广州赛诚生物EMSA核心实验技术：实验流程

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一、探针 的标记

1.如下设置探针标记的反应体系：

(1)待标记探针(1.75 pmol/微升)：2微升。

(2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10X)：1微升。

(3)Nuclease-Free Water：5微升。

(4)[γ-32P]atp (3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml)：1微升。

(5)T4 Polynucleotide Kinase(5-10 u/微升)：1微升。

(6)总体积10微升。

(7)按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase,混匀。

2.使用水浴或PCR仪 ，37℃反应10分钟。

3. 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。

4. 再加入89微升TE,混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。

5. 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。

二、探针的纯化

通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳 结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：

1. 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。

2. 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。

3. 在4℃，12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。

4. 在4℃，12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。

5. 加入100微升TE,完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。

三、EMSA 胶的配制

1. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白 电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。

2. 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶 (注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。

(1)TBE buffer(10X)：1毫升。

重蒸水 16.2毫升。

(2)39:1 acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v)：2毫升。

(3)80甘油：625微升。

(4)10% 过硫酸铵(ammonium persulfate)：150微升。

(5)TEMED：10微升。

按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。

四、EMSA结合反应

1. 如下设置EMSA结合反应。

阴性对照反应：

(1)Nuclease-Free Water :7微升。

(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)：2微升。

(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子：0微升。

(4)标记好的探针：1微升。

(5)总体积：10微升。

样品反应：

(1)Nuclease-Free Water ：5微升。

(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)：2微升。

(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。

(4)标记好的探针：1微升。

(5)总体积：10微升。

探针冷竞争反应：

(1)Nuclease-Free Water ：4微升。

(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)：2微升。

(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。

(4)未标记的探针：1微升。

(5)标记好的探针：1微升。

(6)总体积：10微升。

突变探针的冷竞争反应：

(1)Nuclease-Free Water ：4微升。

(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)：2微升。

(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。

(4)未标记的突变探针：1微升。

(5)标记好的探针：1微升。

(6)体积：10微升。

Super-shift反应：

(1)Nuclease-Free Water：4微升。

(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)：2微升。

(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。

(4)目的蛋白特异抗体：1微升。

(5)标记好的探针：1微升。

(6)总体积 :10微升。

2. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。

3. 加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。

五、电泳分析

1. 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。

2. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。

3. 按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。

4. 剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。

5. 干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。

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作者：广州赛诚生物