分子信标的最新发展
互联网
1942
- 相关专题
分子信标是一种设计巧妙的荧光探针 。在长度为15-30mer寡核昔酸探针的两端分别加上5-8mer序列互补的茎杆区。在自由状态时由于茎杆区互补序列的结合使探针分子形成发夹状结构，所以又被称为发夹探针。探针的5"端及3"端分别联用荧光素分子及碎灭剂分子。为经典的分子信标结构，其中1-氨基蔡-8-叛酸(EDANS)为荧光素，二甲氨基偶氮苯甲酚(DABSYI.)为猝灭剂。自由状态时，发夹结构的两个末端靠近，使荧光分子与碎灭分子靠近(约为7-1Onm)。此时发生荧光共振能量转移，使荧光分子发出的荧光被碎灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。为分子信标的工作原理，当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时，信标茎杆互补区被拉开，荧光分子和碎灭分子距离增大。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。杂交后，信标分子的荧光几乎100%恢复。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。
分子信标中最常用的猝灭剂是DABSYL，它对多种荧光素都有较强的荧光猝灭效率。近来Dubertret等用金纳米粒子簇代替DABSYL做猝灭剂，人们还可以通过调节金属纳米簇的形状、大小和组成而得到不同的猝灭剂。由于金纳米簇对荧光试剂有着更高的猝灭效率，所以用金纳米粒子代替DABSYL后，大大提高了分子信标的灵敏度和特异性
分子信标这一荧光信号传导机制是基于荧光能量转移基础上的。可能有两种能量转移的形式存在：直接的能量转移和荧光共振能量转移。当荧光基团和猝灭基团距离很近时，由于两个基团分子相互碰撞可产生直接的能量转移。当两个基团的距离在且能量给体（荧光基团）的发射光谱与能量受体（猝灭基团）的吸收光谱有较大程度的重叠时，则可发生荧光共振能量转移。由于已发现（二甲基胺基苯基）偶氮苯甲酸可作为分子信标通用的猝灭基团，它对多种发射光谱不同的荧光基团都有很好的猝灭作用。因此，直接的能量转移可能是一种主要的荧光能量转移机制。
分子信标最初被用作聚合酶链反应(PCR )的荧光探针，分子信标工作原理，它既可以对扩增产物进行定量检测，又可以对扩增的过程进行实时的监测最近国内孔德明等设计出了TagMan分子信标，也是一种性能良好的PCR荧光探针。
Tyagi等在发明了传统的分子信标后，又设计了一种荧光波长转移型分子信标，即在分子信标的一末端连接两个不同的荧光基团：荧光收集基团和荧光发射基团，分子信标的另一末端连接猝灭基团。未结合靶分子时，它与传统的分子信标一样，荧光收集基团吸收的能量传给猝灭基团，以热的形式放出，不产生荧光；当与靶分子结合发生构象变化后，荧光收集基团的荧光并未恢复，而是把能量以荧光共振能
量转移的形式转移给荧光发射基团，荧光发射基团将能量以荧光的形式放出。这样可以通过选择不同波长的荧光发射基团，从而使分子信标按设计的要求发出不同颜色的荧光。同时，这种新型的分子信标具有较大的斯托克位移，解决了传统分子信标中激发波长和发射波长差别较小，从而使一部分激发光通过反射和散射到达检测器，影响灵敏度的问题。
TagMan分子信标仍然保留了经典分子信标的茎一环结构，不同的是，TagMan分子信标除环部序列外，其5"一端茎序列也被设计为探针的基因识别部位。当探针与靶标序列发生特异互补杂交形成双链时，Taq酶的5"—3"外切活性即被激活，将探针5" 端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使荧光分子与碎灭分子彻底分开，荧光恢复。TagMan分子信标集中了TagMan探针和分子信标两种探针技术的优点，在杂交和探针降解过程中TagMan分子信标均能产生荧光信号，这使得TagMan探针具有更高的灵敏度。
根据分子信标原理，NobukoHamaguchi等人设计了Aptamer信标用于直接检测蛋白质。他们将抗凝血酶适体(Aptamer)的5"端连上一段ssDNA，使之与适体的3"端部分序列互补，形成茎环结构。自由状态时，荧光分子与碎灭分子靠近，荧光被完全碎灭。当凝血酶存在时，适体会折叠成一定的构象，通过三维结构与凝血酶发生特异性结合。这样Aptamer信标的茎环结构被破坏，荧光分子与猝灭分子分开，荧光恢复。通过改变Aptamer信标的组成或茎杆区的长度，Aptamer信标可以用于不同种蛋白质的测定。与酶联免疫吸附测定蛋白质相比，Aptamer信标技术具有简单、直接、灵敏、省时等优点。人们还可以将多种Aptamer信标固定在芯片上，用于单一蛋白质的检测和分析。Aptamer信标技术的缺点是不能用于检测非特异性ssDNA结合蛋白，而且信标的构象受金属离子影响很大，一些金属离子的存在会干扰荧光信号的观测，特殊的发夹结构使分子信标具有很强的特异性识别靶标序列的能力，目前已成为分子生物学和生物技术中一种强有力的研究工具。
近年来，分子信标技术得以飞速发展，已渗透到结构和分子生物学、基因和生物技术等领域的各个方面。毫无疑问的是分子信标技术有着广阔的应用空间。Chance等人已合成了一种可以诊断乳腺癌的分子信标，这预示着分子信标技术将会给癌症等疾病的诊断和治疗带来重大突破。可以直接用于检测非扩增靶标序列的分子信标技术已经出现，并倍受人们的关注，但提高检测灵敏度仍是这项技术发展的关键，随着微量检测技术和光谱技术的发展以及核酸酶、无机纳米粒子用于分子信标结构的设计，各种新型分子信标的出现，使分子信标灵敏度的进一步提高成为了可能。另外，分子信标还会在研究小分子一DNA的相互作用、蛋白质一DNA的相互作以及生物传感器的研制等领域里继续发挥着自己的优势。
参考文献
