分子信标的原理、应用及其研究进展

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摘要 分子 信标技术是一种基于荧光共振能量转移现象（FRET）和碱基互补配对原则建立起来的一种分析技术。分子信标作为一种荧光标记的分子探针，具有极强的特异性和较高的灵敏度，目前已经成为基础医学和生物学的重要研究工具。本文着重介绍了分子信标的基本原理及其应用，并对其近年来的研究进展做以简单介绍。

1 引言
在基因时代和蛋白质时代，人们迫切需要一种具有高灵敏度和高亲和力的生物分子探针 ，用以进行定性和定量检测。1996年Tyagi和Kramer首先建立了分子信标技术，很快这种技术就广泛的应用于医学、生物学、分子生物学、临床医学和化学等诸多领域。分子信标技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，特别是它可以进行实时定量检测、甚至可以用于活体分析。在临床诊断、基因检测等领域，分子信标也越来越显示出它的优势。近年来，人们对分子信标的结构作了诸多改进，发展出很多具有更多特性的新型分子信标。随着分子信标的发展，该技术也必将在更多领域中发挥出它的优势。

2 分子信标的原理
分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸 链，一般含有25～35个核苷酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区：一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般连接在5ˊ端；淬灭基团一般连接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。
自由状态时，分子信标呈发卡式结构，从而荧光基团和淬灭基团相距较近（约7～10nm）。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标与靶分子结合时，荧光基团和淬灭基团之间的距离加大，从而，分子信标的荧光几乎100%恢复。而且所检测到的荧光强度与溶液中靶标量成正比。

3、影响分子信标的主要因素
分子信标中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响分子信标的最主要因素。根据Foerster理论，荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。
另外，温度也是影响分子信标的一个重要因素。在较低温度下，分子信标才可以保持发卡结构。在较高温度下，分子信标将无法保持其发卡结构，甚至使其伸展为随机线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，从而发出荧光，出现假阳性结果。有文献表明，其熔链温度取决于茎干区的长度、G-C含量和缓冲液的离子强度。
Bonnet等研究温度对分子信标影响时发现，体系的荧光强度呈现为一个先减弱后增强的过程。就此，Bonnet等做出如下解释：

在较低温度下，分子信标与靶标结合呈S1状态，发出荧光。随着温度升高，分子信标与靶标分离，分子信标重新恢复为发卡式结构即S2状态，从而荧光强度减弱。温度持续增高，将导致分子信标熔链即S3状态，荧光基团与淬灭基团分离，导致荧光恢复。
环境pH值也是影响分子信标的一个因素。pH值过高，分子信标的发卡结构可能被破坏，出现假阳性结果。此外，分子信标的纯度，也将对分子信标产生影响。