分子信标技术及其应用研究进展

Tyagi和Krammer于1996年设计了一种可以特异性识别核酸序列的新型荧光探针,这种荧光探针通过与核酸靶分子进行杂交后发生构象的变化而发出荧光,他们将其命名为分子信标(Molecular Beacon)。

分子信标具有背景信号低,灵敏度高、特异识别性强、操作简单，不必与未反应的探针分离即可实时检测，可用于活体分析等优点。
在生物化学分析，生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用价值。

分子信标的结构

（1）环状区（长度15～30个碱基的序列，可以与靶序列特异性结合）

（2）信标茎杆区（长度为5～8个碱基的互补序列，使得形成发夹结构，与靶序列无关）

（3）荧光基团和猝灭基团（通过共价键连接在茎杆区的末端，荧光基团联接在信标分子的5’-端，猝灭基团联接在3’-端）

分子信标作用原理

无靶标存在下，茎环结构使得荧光基团和猝灭基团相互靠近，发生荧光共振能量（FRET）转移，荧光猝灭，荧光背景极低。
加入靶序列后，分子信标与完全互补靶序列形成刚性并且更加稳定的双链杂交体，使得荧光基团和猝灭基团距离增大，阻止了FRET的发生，荧光恢复。

分子信标的设计

序列长度（环状序列比茎杆序列长两倍以上，茎杆序列不能过长或过短）

茎杆序列中G和C的含量不能太高

5’-端的第一个碱基最好不要选择G

由于被测对象DNA或RNA是大分子，存在扭曲现象，因此要选择被测对象的外围碱基序列，即容易接近的那段序列来设计信标。

荧光猝灭依赖的是能量共振转移，而转移的效率与荧光基团发射光谱同猝灭基团激发光谱的完全重叠有关。为了荧光能有效猝灭，荧光基团的发射光谱应完全覆盖猝灭基团激发光谱。符合此要求且较常用的荧光剂-淬灭剂有：
EDANS（5′- (2′-氨乙基氨基奈-1-磺酸)和DABCYL（4′-(4′-二甲基氨基叠氮苯) 苯甲酸
 6-荧光素和DABCYL  、 荧光素和罗丹明、     
 荧光素和芘丁酸   、 香豆素和乙锭
 荧光素和伊红     、 一些铽螯合物和四甲罗丹明等等。
新型的分子信标
波长转移分子信标

 

优点： 如果对不同分子信标探针修饰以具有不同特征发射波长的荧光发射基团，就可在同一激发光下，通过检测这些特征波长的荧光强度， 实现在同一体系中的多基因分析。

分子信标的应用

核酸的检测分析
　　实时定量PCR测定靶标浓度
　　活体内核酸的动态检测
　　同时检测多个靶核苷酸
　　研究DNA—蛋白质的相互作用
　　用于核酸酶的研究
　　用于研究DNA——蛋白质的相互作用

应用1、实时定量PCR测定靶标浓度

将分子信标简单地密封在PCR 管中，在每个循环的退火阶段分子信标与扩增产物结合产生荧光，未结合的分子信标不发荧光，这样荧光信号随着反应循环的增加而增强，从而反映出PCR 过程中扩增产物浓度的增加。

由于加有分子信标的PCR 管在整个反应中是密封的，因此可避免传统PCR后扩增产物凝胶电泳过程带来的污染，简化检测手段，检测灵敏度高。

应用2、活体内核酸的动态检测

目前尚缺乏对生物活体内核酸直接研究的有效方法，分子信标为活体内核酸的代谢运转等动态过程研究提供了可能并已用实验证明。

Perlette 利用微注射法在袋鼠肾细胞质中引入分子信标，对单个活细胞中的RNA 进行了检测，并利用ICCD 成像系统得到了一系列反应分子信标与RNA 结合的荧光图像。结果表明，利用分子信标可以有效地实时检测活细胞中的RNA 及研究RNA/ DNA 的杂交过程。

Perlette J , Tan W H. A nal . Chem. , 2001 , 73 :5544～5550

应用3、同时检测多个靶核苷酸

通过选择不同的荧光分子-猝灭分子对， 可以设计出不同荧光的多个分子信标(又称多色分子信标) ， 每个分子信标与其各自的靶标序列杂交后， 荧光检测系统可以检测到不同颜色的荧光， 这样多色分子信标可对多个靶核苷酸同时定量测定。另外， 波长转移分子信标同样可以用于核酸的多组分同时定量测定。

应用4、用于核酸酶的研究

应用5、用于研究DNA-蛋白质的相互作用

DNA 和蛋白质的相互作用的研究是目前分子生物学和生物技术研究中非常重要并迅速发展的领域。将分子信标用于DNA -蛋白质相互作用的研究， 发挥了其简单、灵敏等特点， 又实现了对体系的实时监测， 甚至可以用于活体细胞的动态研究。

Fang 等以SSB、组蛋白、牛血清蛋白为对象研究了3 者对分子信标的不同影响。结果表明，分子信标能够很好地区分这3 种类型的DNA 结合蛋白;分子信标与SSB 具有很高的亲和力，其结合引起的荧光上升与完全互补的靶相近。并且他们进一步研究了SSB 与分子信标的结合动力学，得出其结合常数与已经报道的结合常数相符。

前景与展望

近年来，分子信标技术得以飞速发展，已渗透到结构和分子生物学、基因和生物技术等领域的各个方面。毫无疑问的是分子信标技术有着广阔的应用空间。

随着研究的深入，分子信标作为一种高特异性、高敏感性的分子探针必将在基因结构、疾病诊断、疾病机制、药物筛选等方面得到更广泛的应用。

参考文献

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