【求助】求助MAPK通路及磷酸化蛋白试验问题

我做的实验是抗肿瘤药对肺纤维化干预作用，研究目标是验证抗肿瘤药是通过MAPK哪些通路起作用，分组如下：
A 空白 对照组
B TGF刺激组
C TGF+ERK阻断剂PD98059
D TGF+JNK阻断剂SP600125
E TGF+P38阻断剂SB283580
F TGF+抗肿瘤药
我的困惑是 1：前期PCR做出来检测1、3型胶原SMA居然没有差异性，考虑为药物降解原因或者TGF配制时未按照说明书用柠檬酸活化
2：做WB检测P—ERK，P--P38、P-JNK 需要血清饥饿24h吗？？
3还有加药怎么加啊？？做PCR都是用阻断剂孵育1h然后加TGF，WB我都是要在15min、30min、60min提蛋白检测。请问加药该如何加，是直接把TGF和阻断剂混匀加嘛？？还是也孵育1h然后加TGF在上述时间提蛋白？？
4大家对该实验设计方面有更好建议的希望不吝指导

希望各位·前辈多多指导，早日完成实验好下临床。

1：前期PCR做出来检测1、3型胶原SMA居然没有差异性，考虑为药物降解原因或者TGF配制时未按照说明书用柠檬酸活化
没看懂
2：做WB检测P—ERK，P--P38、P-JNK 需要血清饥饿24h吗？？
3-24h都有可能,看本底啥时候降到最低来决定.
3还有加药怎么加啊？？做PCR都是用阻断剂孵育1h然后加TGF，WB我都是要在15min、30min、60min提蛋白检测。请问加药该如何加，是直接把TGF和阻断剂混匀加嘛？？还是也孵育1h然后加TGF在上述时间提蛋白？？
先阻断1h,然后加刺激(没有阻断剂),建议也加上5分钟的,很多时候磷酸化甚至2分钟就开始了. 60min又回复到本底了
4大家对该实验设计方面有更好建议的希望不吝指导

谢谢西域骆驼！！！

还有一个问题，内参是选择bactin还是总的erk，jnk，p38或者三个都做分别做p-erk/bactin、erk/bactin.
怕到时候发文章人家让我补总erk，jnk，p38，上面师兄制作啦p-erk/bactin的，不知道这样的发国内核心期刊会不会有影响

你好，请问你现在做的怎么样了？我最近也要准备做相关实验，但是没有一点头绪