免疫荧光实验如何选择和使用荧光直标一抗，你需要注意这四点！

互联网2019-08-27

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一、选择荧光标记要匹配

荧光直标抗体的一个主要优势在于它为多重检测提供了机会，比如现在一些先进的流式细胞仪能检测每个细胞中 20 多个离散参数。在设计多重实验时，应考虑每种荧光基团的独特性质，如最大吸收波长和最大发射波长，消光系数和斯托克斯位移等因素。

对于免疫荧光分析方法，人们要同时检测组织或细胞样本中的多个抗原，常常会利用直标一抗进行免疫荧光共染色，这时一般尽量选择光谱重叠比较少的荧光基团进行组合。比如，我们会选择一个 AF488 标记的抗体和另一个 AF647 标记的抗体进行两个不同蛋白的共染色。

对于流式细胞分析方法，我们对同时检测多个抗原所需的荧光抗体的选择相对容易一些。由于在流式细胞实验过程中，荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响实验的数据质量。因此，需要考虑各种影响流式抗体品质及检测效果的因素，例如抗体特异性、荧光素信号强弱、荧光素标记方式、同型对照等。首先，选择流式荧光抗体一定要满足最基本的条件：抗体有较好的目标蛋白特异性及适用的反应种属。

其次，要根据目标蛋白的丰度，选择匹配的荧光素，来保证合适的荧光强度。如不同荧光标记在不同的仪器上强度不同，以 FACS Calibur 仪器为例：PE>APC>PE-Cy5>PerCP>FITC>PerCP-Cy5.5。通常来说，PE 最强，适用于弱表达抗原。FITC 强度较弱，适用于强表达抗原，使用范围比较广。用户需根据检测的目标蛋白进行具体选择。如果同时检测多个指标：确认流式细胞仪能检测多少个通道：流式抗体每个通道只能选择 1 种荧光素。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。如：实验者同时检测三个指标，可以在下图中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记，FITC、PE 和 PE-cy5。切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响最后结果。

因此，流式细胞仪的通道越多，同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。常用荧光标记包括 FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC 等。

二、荧光试剂保存要妥当

尽管许多荧光基团具有相对的光稳定性，但在保存和染色过程中若未能避光, 则可能导致荧光基团-抗体结合物降解，引起假阴性结果。荧光物质必须在建议温度下小心保存，并始终注意避光，以保护其光谱完整性。另外，串联的荧光基团（如 PE-Cy5）对频繁操作引起的不稳定性特别敏感，大家要注意。

三、操作方案要优化

1. 免疫荧光操作方案的优化

对于免疫荧光实验，从细胞样品处理、固定、通透、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。样品制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，其质量对实验的成败至关重要，这一步关键的是玻片的处理以及细胞的活力。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。封闭最好用与指标一抗相同来源种属的正常血清来进行封闭。对于直标一抗的免疫荧光染色，我们需要考虑抗体的建议稀释度，以实现高的信噪比。若抗体浓度过低，则荧光信号较弱，可能难以与背景区分开，但抗体浓度过高，则会导致较高的背景染色。

另外，要注意各步骤之间的彻底洗涤的重要性，利用生理溶液来洗涤，可去除未结合的荧光试剂，或那些只是粘在目标上而非特异性结合的荧光试剂，从而提高信噪比。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在 4℃ 或- 20℃ 避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。尽管免疫荧光技术提供了准确的结果，但也存在一些缺点，包括自发荧光、荧光信号的淬灭。因此，可以针对上述问题，利用一些免疫荧光专用细胞处理试剂去进行预处理，以减少自发荧光或荧光信号的淬灭。

2. 流式细胞术操作方案的优化

流式细胞术操作方案的优化，主要包括以下几个方面：

选择固定剂

（1）变性试剂：通过将蛋白变性再固定在细胞结构上的有机溶剂，如 90% 甲醇、70% 乙醇等，变性试剂一般与细胞膜磷脂双分子层有相互作用，因此同时具有破膜作用。如果采用变性试剂固定细胞，而抗体用来标记胞内蛋白，则不需要另外破膜。

（2）交联试剂：通过自由氨基基团使蛋白分子交联起来固定蛋白，如 4% 多聚甲醛、10% 福尔马林溶液等，如果采用交联试剂固定细胞，而抗体用来标记胞内蛋白，则需要另外破膜。
优化抗体使用浓度

抗体滴定方法：用同种细胞，相同细胞数量与反应体积，加入不同量的抗体计算阳性峰荧光强度及信噪比（S/N>3）。

（1）滴定的浓度范围尽量大，至少 5 个左右。

（2）滴定实验条件要和实际实验条件一致，如反应温度、pH 等。

（3）弱表达或不分群的抗原不适合做滴定。
封闭 Fc 受体

Fc 受体是指细胞表面能够与免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM、IgE 和 IgD）结合的分子，存在于 NK 细胞、肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的表面。FcR 能够与抗体的 Fc 段结合，在检测时产生假阳性。

（1）商品化的 Fc Block 试剂：重组人 IgG，小鼠 CD16 /CD32 抗体。

（2）人血清或相应物种的血清
排除死细胞

死细胞的自发荧光水平很高，且容易摄取抗体导致非特异性结合，最终影响实验结果；还可能会释放 DNA，DNA 非常粘稠，会导致细胞成团，容易堵塞管路。

区分死细胞的方法

死细胞特性：细胞膜渗透性增强，失去膜完整性

（1）DNA 结合染料：PI、DAPI、7 -AAD、TO-PRO- 3 等 DNA 染料只会进入细胞膜受损的细胞，结合到细胞的 DNA 上, 图三门 R3 中为 7 -AAD 阴性，即为活细胞。

（2）蛋白结合染料：结合细胞表面或膜内的游离胺，活细胞弱阳，死细胞强阳。可以用在固定标本中的，区分样本固定细胞状态。

四、要设立必要的对照

对于免疫荧光或流式细胞分析实验，由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像 WB 那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个可信的实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。对于荧光直标抗体，我们建议使用抗体的同型对照，即与抗体同一个来源种属的正常同型 IgG 作为对照，对样品进行平行染色，来确定抗体的染色是否特异。此外，我们还可以使用不表达目标的细胞或组织作为阴性样品对照。同时，为了确保所有组分都正常发挥作用，那些已知表达目标的阳性对照也少不了。