你是否苦于你纯化的标签蛋白无法达到理想纯度而日夜发愁？是否在换了新的标签后仍不太满意而承受老板们鬼畜般的霹雳大吼？朋友别哭，相信这篇文章可以为你带来纯化高纯度蛋白的新思路。

进行蛋白质功能研究的关键在于得到高纯度蛋白。习惯于构建单标签的你想必遇到过杂质太多，蛋白表达量少甚至不稳定的情况。何不根据目的蛋白性质构建双标签蛋白进行两种不同亲和层析柱的纯化？没准会有意想不到的效果。

01双标签蛋白助力于目的蛋白的高特异性
单组氨酸标签蛋白的亲和层析结果通常不能保证杂蛋白的有效去除。为获得更高纯度，常规思路是使用分子筛或离子交换进行进一步纯化。除了应用不同层析策略外，我们还可以从标签设计入手，引入一个新标签以构建双标签蛋白，从而增加目的蛋白的特异性。

下图展示的是 E.coli 表达的双标签蛋白 StrepⅡ-六组氨酸-蛋白（相对分子量：约 15400）使用两步亲和层析进行纯化。首先使用 HisTrap HP 进行固定金属亲和层析（IMAC），再使用 Strep Trap HP 进一步亲和纯化。SDS-PAGE 结果清楚地论证了双标签法对获得高纯度蛋白的优势。

双标签蛋白 StrepⅡ-六组氨酸-蛋白

02双标签蛋白可促进目的蛋白增溶性和特异性双重提高

当组氨酸标签蛋白表达量低，或纯化过程中蛋白不稳定时，可能是由于目的蛋白疏水性强导致溶解性不高、或未能正确折叠形成包涵体影响纯化效果。大分子增溶性蛋白标签，如 GST、MBP 标签可改善这一问题。但一步亲和难以满足高纯度蛋白的要求。大分子标签与小分子标签组合的双标签蛋白不仅可以提高目的蛋白溶解性和稳定性，还可以提高目的蛋白的特异性。
下图展示的是双标签绿色荧光蛋白（六组氨酸-绿色荧光蛋白-谷丙转氨酶）使用单一亲和层析和两步亲和层析的对比实验。HisTrap HP 纯化结果显示，填料对其它含有暴露的组氨酸残基的蛋白也具有亲和作用。GST 标签与 GSTrap 4B 上的谷胱甘肽配基特异性较高，可以产生较高纯度的蛋白。两个标签组合纯化可以得到最高纯度的蛋白。
双标签绿色荧光蛋白

结语