生物芯片简介及各种芯片之间的差别

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生物芯片技术 从诞生以来就受到相关科研人员的广泛关注与认同，是未来10年最具发展潜力的技术。本文从生物芯片的特点、分类、制备步骤、发展动向、相关仪器、各种芯片之间的差别等方面对这一技术进行全面介绍。

一、生物芯片的定义

生物芯片(Biochip或Bioarray)是指包被在固相载体 上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵(microarray)。

生物芯片包括DNA芯片、抗原 芯片、抗体芯片、细胞芯片、组织芯片等。

1998年世界十大科技突破之一。

未来十年最具发展潜力的技术。

二、特点

1.高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱 的快速对照和阅读。

2.多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。

3.微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。

4.自动化：降低成本，保证质量。

三、生物芯片分类

尚未统一。广义上：矩阵型芯片、处理型芯片。根据固化材料可分为基因芯片 、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片

1.分类(根据应用)

1)基因变异检测芯片

– 疾病检测(如HIV、P53基因、结核杆菌)

– 法医鉴定(如DNA指纹图谱)

2)表达谱芯片

– 肿瘤相关基因(正常与肿瘤组织表达差异)

– 药物筛选(培养细胞药物刺激前后表达差异)

– 发育(同一组织不同发育时期基因表达差异)

– 组织发生(不同组织或器官的基因表达差异)

2.根据工艺和载体

1)原位合成法：密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸，但特异性较差，寡聚核苷酸合成长度有限，且随长度增加，合成错误率增高。成本较高，设计和制造较烦琐费时。

2)DNA微矩阵法：成本低，易操作，点样密度通常能满足需要。芯片的载体需表面紧质、光滑的固体，如硅，陶，玻璃等，DNA微矩阵芯片常用玻片为载体。

3.根据DNA成分

1)寡聚核苷酸或DNA片段：约20~25个核苷酸碱基，常用于基因类型的分析，如突变、正常变异(多态性)。

2)全部或部分cDNA：约500~5000个核苷酸碱基，通常用于两种或以上样本的相关基因表达分析。

四、生物芯片技术主要环节

1.芯片制备：微点阵

2.样本制备：DNA提纯、扩增、标记

3.杂交：样本与互补模板形成双链

4.检测：共聚焦扫描，双色激光

5.数据处理：定量软件，数据库检索，RNA印迹等。

6.结果

五、生物芯片分析的原则

1、测定过程应包括五个基本步骤：

– 需解决的生物学问题

– 样本制备

– 生物化学反应

– 检测

– 数据分析

2、生物学系统控制必须精确地与检测目的相匹配。

3、生物学样本必须精确地与生物学种类相匹配。

4、所有基因分析必须平行处理。

5、基因分析技术必须适合微型化和自动化。

6、平行格式必须精确的依据生物学样本的次序。

7、检测系统必须能精确地获得数据。

8、检测系统获得的数据必须能被精确地控制和重复。

9、两种或以上平行数据组比较应受到单个实验所固有特性的限制。

10、绝对比例关系只存在于组合实验的平行数据组内。

11、平行格式包括内在和外部的整个系统误差的分析因素。

12、在每个系统模块中采集到该系统所有变量的四维数据时，才能称为完成生物系统平行基因分析。

六、 芯片技术过程

(一)芯片制备

1.原位合成法(in situ synthesis):又可分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法。适用于寡核苷酸，使用光引导化学原位合成技术。是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法。

2.合成后交联(post-synthetic attachment):利用手工或自动点样装置将预先制备好的寡核苷酸或cDNA样品点在经特殊处理过的玻片或其他材料上。主要用于诊断、检测病原体及其他特殊要求的中、低密度芯片的制备。

3.两种制备方法比较

1)原位合成：测序、查明点突变，根据已知的DNA编制程序设置高密度探针，但制作复杂、价格昂贵、不能测定未知DNA序列

2)合成后交联：比较分析。制备方式直接和简单，点样的样品可事先纯化，

交联方式多样，可设计和制备符合自己需要的芯片。中、低密度，样品浪费较多且

制备前需储存大量样品。

(二)样本制备

制备高质量样本是困难的但又是极其重要的。制备细胞、组织或整个器官样本应特别小心。温度、激素和营养环境、遗传背景、组织成分等轻微改变都会使基因表达的结果发生明显变化。用于基因类型分析的样本是DNA，用于表达研究的样本是cDNA。样本制备后应进行标记，通常为酶标记、荧光标记和核素标记。

(三)杂交

是芯片技术中除方阵构建外最重要的一步液相中探针与DNA片段按碱基配对规则形成双链反应。

– 选择杂交条件时，必须满足检测时的灵敏度和特异性。使能检测到低丰度基因，且能保证每条探针都能与互补模板杂交。

– 合适长度的DNA有利于与探针杂交。

– 温度、非特异性本底等均会影响杂交结果。

– 最好在封闭循环条件下杂交，杂交炉。

(四)结果分析

芯片与标记的靶DNA或RNA杂交后，或与标记的靶抗原或抗体结合后，可采用下列方法分析处理数据：

1.共聚焦扫描仪：应用最广，重复性好但灵敏度较低。

2.质谱法：快速、精确，可准确判断是否存在基因突变和精确判断突变基因的序列位置。探针合成较复杂。

3.化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接电荷变化检测等。

(五)芯片扫读装置

根据采用的光电偶合器件，分为光电倍增管型和CCD型。根据激光光源，可分为激光型和非激光型。目前应用最为广泛的是激光光源的共聚焦扫描装置，分辨率、灵敏度极高，有良好的定位功能，可定量，应用广泛。

(六)图象分析

• 复杂的杂交图谱一般需由图象分析软件来完成。

• 分析软件的功能：鉴定每个点阵、最大限度消除本底荧光的干扰、解析多种颜色图象、可标记或排除假阳性、识别和分析对照实验是否成功、可将信号标准化等。

• 图象处理软件必须具备提取基因库和数据库的能力。

(七)质量控制

实验对照：体外转录从cDNA合成mRNA，参入标本中作为对照。此mRNA不与点阵的核酸杂交。将不同浓度的不同基因参入标本中，可作为标本间标准化的参照。

用两种不同吸收光谱的荧光素同时分析两个标本，如果两种荧光强度一致，可排除

标本间变异因素。用单一碱基错配的寡核苷酸做对照可排除交叉杂交。

结果有效性的证实：

在表达矩阵上，有时难于区分极其相似的序列，如基因族成员，亚类或异类的存在。比较两种不同DNA序列表达水平时，有些参数如核苷酸的成分、二级结构的存在和矩阵上DNA的长度都会影响杂交。证实矩阵分析的结果可用RT-PCR(区别基因族成员，比较不同DNA种系表达，证实基因变异或突变和精确测定DNA表达水平)、Northern Blot(证实某一基因的相对表达水平)、Western Blot(RNA表达是否达到细胞中的蛋白水平)、质谱仪(证实矩阵结果是否在蛋白水平)等。

七、生物芯片技术的应用

1.基因表达分析：肿瘤

2.基因突变检测：遗传性疾病

3.测序、基因图绘制和多态性分析：测序

4.微生物菌种鉴定：毒力基因、抗药基因

5.药物研究：新药筛选、指导合理用药

6.克隆选择及文库筛选

八、生物芯片技术的发展趋势：

– 微型化：DNA矩阵越来越小。

– 集成化：矩阵上的基因组越来越大。

– 多样化：测定范围越来越广。

– 微量化：测定所需样本越来越少。

– 全自动化：样品制备到结果显示全部分析过程。

– 定量化：如激光捕获技术，显微解剖技术等可精确测定一个细胞内的一个基因的表达。

– DNA矩阵数据信息库的完善。

九、生物芯片技术的发展

毛细管电泳芯片技术、PCR芯片技术(PCR-Chip)、缩微芯片实验室(lab-on-a-chip)、微珠芯片技术(beadArray)、抗体和蛋白质阵列技术(Antibody and protein-array technology)、自我定制芯片技术(make your own chip)、血气分析芯片。

1.毛细管电泳芯片技术

Mathies最早报道毛细管电泳芯片测序结果，在10分钟内完成了对433个碱基序列的测定。宾夕法尼亚大学Wilding等成功地利用毛细管电泳芯片分离了用于诊断杜鑫-贝克肌萎缩的多条DNA片段。瑞士Ciba-Geigy公司和加拿大Alberta大学合作利用玻璃毛细管电泳芯片完成了对寡核苷酸的分离。

2.缩微芯片实验室

在一张芯片上完成样品(如血液、组织等)制备、化学反应、检测和数据分析。

1998年程京博士首次应用LOC实现了从样品制备到反应结果显示的全部过程，成果地从混有大肠杆菌的血清中分离出了细菌。含有加热器、微泵微阀、微流量控制器、电子化学和电子发光探测器的芯片已经问世。也已出现样品制备、化学反应和分析检测部分结合的芯片。LOC与卫星传输和网络生物信息学结合，将实现高通量、一体化和移动性的“未来型掌上实验室”的构想。

抗体和蛋白质阵列技术

乳腺癌基因芯片

Stanford 乳腺癌微矩阵(Perou et al.1999)

每种基因的数据以行表示，每个实验用列表示。颜色强度表示对照和实验cDNA的比率。比率相同时为1。结果为红色表示mRNA增加，绿色表示减少，灰白色表示缺乏。两种基因的相似性用Pearson相关公式或Euclidian测距公式计算。

根据已有的序列数据，组合800000人类EST序列，已重矩阵了38000克隆用于RNA表达分析，克隆经PCR扩增后共价结合于玻片上，每张玻片固定19200个基因片段，标记人组织RNAs与被选的38000人基因片段的矩阵进行杂交，比较健康与疾病组织的图象，用软件分析点识别和点定量。使用寡聚核苷酸鉴定新的cDNA克隆，和进入表达载体，使相应蛋白能直接表达，矩阵后可分析蛋白-蛋白和蛋白-DNA的关系。

十、芯片相关仪器

1.点阵仪：制备芯片。点样针分为实心和空心两种，点样方式有非接触喷点和接触点样两种。

2.杂交仪：全自动完成调节、加探针、漂洗和热循环的杂交过程。

3.扫描仪：激光共聚焦或CCD直接成像分析结果。

Q Bot

超高解析基因筛选暨排列分析仪。

基因菌落筛选(Colony Picking)：3500/h

基因排列打点(Gridding)：100000/h

基因复制(Replication)：96Û96，96Û384

基因重新排列(Re-Arraying)：正确的基因置复制盘

基因微矩阵排列(Micro-Arraying)：20000/片

全自动液体分注系统(Liquid Handling):96针，注液量1~200ml，适合PCR产物。

分析软件：分析、质控、上网。

环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板

Q Pix

• 半敞开式基因筛选暨排列分析仪(经济型)

– 基因菌落筛选(Colony Picking)：3500/h

– 基因排列打点(Gridding)：100000/h

– 基因复制(Replication)：96Û96，96Û384

– 基因重新排列(Re-Arraying)：正确的基因置复制盘

– 基因微矩阵排列(Micro-Arraying)：20000/片

– 分析软件：分析、质控、上网

– 环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板

Q Array

• 第三代半敞开式基因微矩阵排列仪。

– 基因微矩阵排列(Microarrying)：同时处理84片玻片，每一打点玻片分4个区域，可安排不同的矩阵排列。可选16或24针座。

– 仪器容量：玻片84片，玻片架6个，384孔板5盘。

– 分析软件：分析、质控、上网。

– 环境控制：紫外线照射、空气滤网、阳极处理铝板。

杂交仪

• Affymetrix 640杂交仪：

– 温度范围：0~100°C

– 探针用量：ml

– 流速： 10ml/min

– 样本区： 2.4´6.4cm

扫描仪

• GenearrayTM扫描仪：

– 激光：氩离子，488nm

– 适用染料：荧光素、藻红素

– 单扫描时间：<4分钟

– 分辨率：3、6、9或24微米

十一、组织芯片与DNA芯片和蛋白质芯片比较有哪些异同?

DNA 芯片比较简单，就是在芯片上事先印上含有目标基因序列的核苷酸片段，然后把标记好的样本与之进行杂交。

蛋白芯片有好几种，如果要研究DNA-蛋白质间的结合，那么事先点在上面的就是DNA片段。如果要研究蛋白质间的结合，那么点在上面的就是蛋白质。如果要鉴定蛋白，那点在上面的就是抗体。

组织芯片就是将大量组织(或细胞、微生物蛋白质、RNA)样品有序地组合在一个微小基片表面，借助免疫组织化学、原位杂交、原位PCR等方法进行检测。

还是有点绕?那看表格吧。

	组织芯片	蛋白芯片	基因芯片
靶分子种类	不同样本同一蛋白、基因	同一样本不同蛋白	同一样本不同基因
标本类型	组织标本	体液、组织提取液中蛋白	核酸
检测方法	原位	非原位	非原位
分析工具	光学显微镜	扫描仪	扫描仪
制备工艺	简单	中等	复杂
成本	低	中等	高
自动化程度	低	中等	高
仪器	手动为多	自动化	自动化

相信随着生物技术与计算机技术等的进一步发展，生物芯片技术的发展和应用将越来越受瞩目。关于这项技术，这里给大家推荐DNA芯片专题http://www.bio1000.com/zt/experiment/dna/3782.html ，您可对生物芯片的相关软件、科研进展、相关知识和产品等有更深更广的认识。