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生物芯片入门(一):生物芯片及应用简介

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一、简介

生物芯片(biochip)是指采用光导原位合成或微量点样等方法,将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面,组成密集二维分子排列,然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交,通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析,从而判断样品中靶分子的数量。由于常用玻片/硅片作为固相支持物,且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术,所以称之为生物芯片技术。

根据芯片上的固定的探针不同,生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片,另外根据原理还有元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。如果芯片上固定的是肽或蛋白,则称为肽芯片或蛋白芯片;如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或DNA,就是DNA芯片。由于基因芯片(Genechip)这一专有名词已经被业界的领头羊Affymetrix公司注册专利,因而其他厂家的同类产品通常称为DNA微阵列(DNA Microarray)。

这类产品是目前最重要的一种,有寡核苷酸芯片、cDNA芯片和Genomic芯片之分,包括二种模式:一是将靶DNA固定于支持物上,适合于大量不同靶DNA的分析,二是将大量探针分子固定于支持物上,适合于对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。

生物芯片技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一,是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术,具有重大的基础研究价值,又具有明显的产业化前景。由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上,所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析,从而解决了传统核酸印迹杂交(Southern Blotting 和Northern Blotting等)技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量(low through-put)等不足。

而且,通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值,如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序(Sequencing by hybridization,SBH)等,为“后基因组计划”时期基因功能的研究及现代医学科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具,将会使新基因的发现、基因诊断、药物筛选、给药个性化等方面取得重大突破,为整个人类社会带来深刻广泛的变革。该技术被评为1998年度世界十大科技进展之一。

二、应用领域

1、基因表达水平的检测

用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列(其中14个为完全序列,31个为EST),检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平,用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交,经激光共聚焦显微扫描,发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异,而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。

Schena等用人外周血淋巴细胞的cDNA文库构建一个代表1046个基因的cDNA微阵列,来检测体外培养的T细胞对热休克反应后不同基因表达的差异,发现有5个基因在处理后存在非常明显的高表达,11个基因中度表达增加和6个基因表达明显抑制。该结果还用荧光素交换标记对照和处理组及RNA印迹方法证实。在HGP完成之后,用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期不远了。

2、基因诊断

从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱,就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点,将成为一项现代化诊断新技术。例如Affymetrix公司,把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上,制成P53基因芯片,将在癌症早期诊断中发挥作用。

又如,Heller等构建了96个基因的cDNA微阵,用于检测分析关节炎、风湿性关节炎(RA)相关的基因,以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用。现在,肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用。


3、药物筛选

如何分离和鉴定药的有效成份是目前中药产业和传统的西药开发遇到的重大障碍,基因芯片技术是解决这一障碍的有效手段,它能够大规模地筛选、通用性强,能够从基因水平解释药物的作用机理,即可以利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。如果再cDNA表达文库得到的肽库制作肽芯片,则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。还有,利用RNA、单链DNA有很大的柔性,能形成复杂的空间结构,更有利与靶分子相结合,可将核酸库中的RNA或单链DNA固定在芯片上,然后与靶蛋白孵育,形成蛋白质-RNA或蛋白质-DNA复合物,可以筛选特异的药物蛋白或核酸,因此芯片技术和RNA库的结合在药物筛选中将得到广泛应用。在寻找HIV药物中,Jellis等用组合化学合成及DNA芯片技术筛选了654536种硫代磷酸八聚核苷酸,并从中确定了具有XXG4XX样结构的抑制物,实验表明,这种筛选物对HIV感染细胞有明显阻断作用。生物芯片技术使得药物筛选,靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高,成本大大降低。基因芯片药物筛选技术工作目前刚刚起步,美国很多制药公司已开始前期工作,即正在建立表达谱数据库,从而为药物筛选提供各种靶基因及分析手段。这一技术具有很大的潜在应用价值。

4、个体化医疗

临床上,同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用,而对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面,病人的反应差异很大。这主要是由于病人遗传学上存在差异(单核苷酸多态性,SNP),导致对药物产生不同的反应。例如细胞色素P450酶与大约25%广泛使用的药物的代谢有关,如果病人该酶的基因发生突变就会对降压药异喹胍产生明显的副作用,大约5%~10%的高加索人缺乏该酶基因的活性。现已弄清楚这类基因存在广泛变异,这些变异除对药物产生不同反应外,还与易犯各种疾病如肿瘤、自身免疫病和帕金森病有关。如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断,再开处方,就可对病人实施个体优化治疗。另一方面,在治疗中,很多同种疾病的具体病因是因人而异的,用药也应因人而异。例如乙肝有较多亚型,HBV基因的多个位点如S、P及C基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间就检测一次,这对指导用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。又如,现用于治疗AIDS的药物主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂,但在用药3~12月后常出现耐药,其原因是rt、pro基因产生一个或多个点突变。Rt基因四个常见突变位点是Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Phe、Tyr和Lys219→Glu,四个位点均突变较单一位点突变后对药物的耐受能力成百倍增加。如将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA芯片,则可快速地检测病人是这一个或那一个或多个基因发生突变,从而可对症下药,所以对指导治疗和预后有很大的意义。

5、测序

基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列,这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。Mark chee等用含135000个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因组序列,准确率达99%。Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差异,结果发现在外显子11约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之间,提示了二者在进化上的高度相似性。据未经证实的报道,近年有一种不成熟的生物芯片在15分钟内完成了1.6万个碱基对的测定,96个这样的生物芯片的平行工作,就相当于每天1.47亿个碱基对的分析能力!


6、生物信息学研究

人类基因组计划(HGP)是人类为了认识自己而进行的一项伟大而影响深远的研究计划。目前的问题是面对大量的基因或基因片断序列如何研究其功能,只有知道其功能才能真正体现HGP计划的价值--破译人类基因这部天书。后基因组计划、蛋白组计划、疾病基因组计划等概念就是为实现这一目标而提出的。基因的功能并不独立的,一个基因表达的上调或者下调往往会影响上游和下游几个基因表达状态的改变,从而进一步引起和这几个基因相关的更多基因的表达模式的改变。基因之间的这种复杂的相互作用组成了一张交错复杂的立体的关系网。像过去那样孤立的理解某个基因的功能已经远远不够了,需要我们站在更高的层次全面的理解这种相互关系,全面了解不同个体基因变异、不同组织、不同时间、不同生命状态等的基因表达差异信息,并找出其中规律。生物信息学将在其中扮演至关重要的角色。基因芯片技术就是为实现这一环节而建立的,使对个体生物信息进行高速、并行采集和分析成为可能,必将成为未来生物信息学研究中的一个重要信息采集和处理平台,成为基因组信息学研究的主要技术支撑。比如研究基因生物学功能的最好方式是监测基因在不同组织、不同发育阶段、不同健康状况下在机体中活性的变化。这是一项非常麻烦的工作,但基因芯片技术可以允许研究人员同时测定成千上万个基因的作用方式,几周内获得的信息用其它方法需要几年才能得到。

由于人类基因只是地球上几十万种生物基因资源中的一份子,在今后的几十年内,人类将测出所有物种的“基因图谱”。因此,类似如人类基因组计划的上调或者下调往往会影响上游和下游几个基因表达状态的改变,从而进一步引起和这几个基因相关的更多基因的表达模式的改变。基因之间的这种复杂的相互作用组成了一张交错复杂的立体的关系网。像过去那样孤立的理解某个基因的功能已经远远不够了,需要我们站在更高的层次全面的理解这种相互关系,全面了解不同个体基因变异、不同组织、不同时间、不同生命状态等的基因表达差异信息,并找出其中规律。生物信息学将在其中扮演至关重要的角色。基因芯片技术就是为实现这一环节而建立的,使对个体生物信息进行高速、并行采集和分析成为可能,必将成为未来生物信息学研究中的一个重要信息采集和处理平台,成为基因组信息学研究的主要技术支撑。比如研究基因生物学功能的最好方式是监测基因在不同组织、不同发育阶段、不同健康状况下在机体中活性的变化。这是一项非常麻烦的工作,但基因芯片技术可以允许研究人员同时测定成千上万个基因的作用方式,几周内获得的信息用其它方法需要几年才能得到。

由于人类基因只是地球上几十万种生物基因资源中的一份子,在今后的几十年内,人类将测出所有物种的"基因图谱"。因此,类似如人类基因组计划的基因研究和生物信息产业,还仅仅是一个起步,其将来的发展前景是无法估量的。生物芯片作为生物信息学的主要技术支撑和操作平台,其广阔的发展空间就不言而喻。

在实际应用方面,生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物基因组图谱、药物筛选、中药物种鉴定、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径,为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台,这从我国99年3月国家科学技术部刚起草的《医药生物技术“十五”及2015年规划》中便可见一斑:规划所列十五个关键技术项目中,就有八个项目(基因组学技术、重大疾病相关基因的分离和功能研究、基因药物工程、基因治疗技术、生物信息学技术、组合生物合成技术、新型诊断技术、蛋白质组学和生物芯片技术)要使用生物芯片。生物芯片技术被单列作为一个专门项目进行规划。总之,生物芯片技术在医学、生命科学、药业、农业、环境科学等凡与生命活动有关的领域中均具有重大的应用前景。


生物芯片技术

20世纪90年代初开始实施的人类基因组计划(Human genome project,HGP)取得了人们当初意料不到的巨大进展。目前已经测定了十多种微生物以及高等动植物的全基因组序列,海量的基因序列数据正在以前所未有的速度膨胀。一个现实的科学问题摆到了人们面前:如何研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能?如何有效利用如此海量的基因信息揭示人类生老病死的一般规律,并为人类最终战胜各种病魔提供有效武器?于是,一项类似于计算机芯片技术的新兴生物高技术随着人类基因组研究的进展应运而生了。生物芯片的种类生物芯片是近10年在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术。它主要是指通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统,以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其他生物组分进行准确、快速、大信息量的检测。目前常见的生物芯片分为三大类:即基因芯片(Genechip,DNAchip,DNAmicroarray)、蛋白芯片(Proteinchip)、芯片实验室(Lab-on-a-chip)等。

生物芯片主要特点是高通量、微型化和自动化。生物芯片上高度集成的成千上万密集排列的分子微阵列,能够在很短时间内分析大量的生物分子,使人们能够快速准确地获取样品中的生物信息,检测效率是传统检测手段的成百上千倍。生物芯片将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。基因芯片是生物芯片技术中发展最成熟和最先实现商品化的产品。基因芯片是基于核酸探针互补杂交技术原理而研制的。所谓核酸探针只是一段人工合成的碱基序列,在探针上连接上一些可检测的物质,根据碱基互补的原理,利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。基因芯片,又称DNA芯片,DNA微阵列(DNAmicroar ray),和我们日常所说的计算机芯片非常相似,只不过高度集成的不是半导体管,而是成千上万的网格状密集排列的基因探针,通过已知碱基顺序的DNA片段,来结合碱基互补序列的单链DNA,从而确定相应的序列,通过这种方式来识别异常基因或其产物等。目前,比较成熟的产品有检测基因突变的基因芯片和检测细胞基因表达水平的基因表达谱芯片。基因芯片技术主要包括四个基本技术环节:芯片微阵列制备、样品制备、生物分子反应和信号的检测及分析。

目前制备芯片主要采用表面化学的方法或组合化学的方法来处理固相基质如玻璃片或硅片,然后使DNA片段或蛋白质分子按特定顺序排列在片基上。目前已有将近40万种不同的DNA分子放在1平方厘米的高密度基因芯片,并且正在制备包含上百万个DNA探针的人类基因芯片。生物样品的制备和处理是基因芯片技术的第二个重要环节。生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体,除少数特殊样品外,一般不能直接与芯片进行反应。要将样品进行特定的生物处理,获取其中的蛋白质或DNA、RNA等信息分子并加以标记,以提高检测的灵敏度。第三步是生物分子与芯片进行反应。芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中,减少生物分子之间的错配比率,从而获取最能反映生物本质的信号。基因芯片技术的最后一步就是芯片信号检测和分析。目前最常用的芯片信号检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中,通过采集各反应点的荧光强弱和荧光位置,经相关软件分析图像,即可以获得有关生物信息。

蛋白芯片与基因芯片的原理相似。不同之处有,一是芯片上固定的分子是蛋白质如抗原或抗体等。其二,检测的原理是依据蛋白分子、蛋白与核酸、蛋白与其它分子的相互作用。蛋白芯片技术出现得较晚,尚处于发展时期,最近也取得了重大进展。例如,最近一期国际著名科学(Science)杂志报道了酵母蛋白质组芯片(proteomechip)。这是目前为止第一个包含一种生物全部蛋白质分子的蛋白质芯片。相信,不久将会有包含更高等生物甚至人类蛋白质组的蛋白质芯片研制成功,并应用于生物医学基础研究和疾病诊断。芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品制备、生化反应以及检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统。现在已有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片实验室问世,并出现了将生化反应、样品制备、检测和分析等部分集成的生物芯片。

例如可以将样品制备和PCR扩增反应同时在一块小小的芯片上完成。再如GeneLogic公司设计制造的生物芯片可以从待检样品中分离出DNA或RNA,并对其进行荧光标记,然后当样品流过固定于栅栏状微通道内的寡核苷酸探针时便可捕获与之互补的靶核酸序列。应用自主开发的检测设备即可实现对杂交结果的检测与分析。这种芯片由于寡核苷酸探针具有较大的吸附表面积,可以很灵敏地检测到稀有基因的变化。同时,由于该芯片设计的微通道具有浓缩和富集作用,所以可以加速杂交反应,缩短测试时间,从而降低了测试成本。国内外研究现状生物芯片技术的飞速发展引起了世界各国的广泛关注和重视。1998年6月29日美国宣布正式启动生物芯片计划,美国国立卫生部、能源部、商业部、司法部、国防部、中央情报局等均参与了此项目。


同时斯坦福大学、麻省理工学院及部分国家实验室也参与了该项目的研究和开发。世界各国也纷纷加大投入,英国剑桥大学、欧亚公司正在从事该领域的研究。世界大型制药公司尤其对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣,都已建立了或正在建立自己的芯片设备和技术。以生物芯片为核心的相关产业正在全球崛起,目前美国已有10多家生物芯片公司股票上市,平均每年股票上涨75%。专家统计:全球目前生物芯片工业产值为10亿美元左右,预计今后5年之内,生物芯片的市场销售可达到200亿美元以上。

美国《财富》杂志刊文指出,微处理器使我们的经济发生了根本变化,给人类带来了巨大的财富,改变了我们的生活方式。然而,生物芯片给人类带来的影响可能更大。在20世纪科技史上有两件事影响深远,一是微电子芯片,它是计算机和许多家电的心脏,它改变了我们的经济和文化生活,并已进入每一个家庭;另一件事就是生物芯片,它将改变生命科学的研究方式,革新医学诊断和治疗,极大地提高人口素质和健康水平。

生物芯片作为基因工业的一部分,可广泛用于医学临床诊断、药物开发、环境监测等领域,有着广阔的市场前景,对人类生活与健康将产生多方面深远影响。鉴于生物芯片技术具有巨大理论意义和实际价值,也为了我国生物芯片技术不再重蹈计算机芯片的覆辙,我国政府、科技界和商业界几乎同时意识到生物芯片技术的重大战略意义和蕴藏的无限商机,开展了生物芯片技术研发。其中最具代表性的事件就是2000年初由国内从事生物芯片技术研究的多家单位进行强强联合成立了国家生物芯片技术中心。中国工程院2000年1月6日在京举办首次工程科技论坛,专题定为“生物芯片技术”,与会科学家呼吁:以生物芯片技术为核心的各相关产业正在全球崛起,世界工业发达国家已开始有计划、大投入、争先恐后地对该领域知识产权进行保护。我国应迅速制定适合中国国情的对策,以避免出现像计算机产业那样因没有自己的芯片专利和技术而受制于人的被动局面。目前国内已有多家科研单位开始从事这方面的研究。例如,清华大学、中国科学院、军事医学科学院等单位在国内率先开展了生物芯片技术研究,建立了生物芯片技术体系,并已在生物芯片技术和产品开发方面取得了较大突破。可以相信不久将有我国自主生产的生物芯片产品投放市场。

生物芯片的应用生物芯片应用前景十分广阔。如可以应用于寻找新基因、DNA测序、疾病诊断、药物筛选、毒理基因组学、农作物优育和优选、环境检测和防治、食品卫生监督以及司法鉴定等等。使用基因芯片分析人类基因组,可找出癌症、糖尿病由遗传基因缺陷引起疾病的致病的遗传基因。生物医学研究人员可以在数秒钟内鉴定出导致癌症的突变基因。借助一小滴测试液,医生们能预测药物对病人的功效和是否有毒副作用。利用基因芯片分析遗传基因,未来可以使糖尿病的确诊率达到50%以上。可以想象,未来人们在体检时,由搭载基因芯片的诊断机器人对受检者取血,转瞬间体检结果便可以显示在计算机屏幕上。利用基因诊断,医疗将从目前千篇一律的“大众医疗”的时代,过渡到依据个人遗传背景而异的“个体化医疗”的时代。生物芯片在疾病检测诊断方面具有独特的优势,它可以在一张芯片上同时对多个病人进行多种疾病的检测。仅用极小量的样品,在极短时间内,向医务人员提供大量的疾病诊断信息,这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。例如对肿瘤、糖尿病、传染性疾病等常见病和多发病的临床检验及健康人群检查,均可以应用生物芯片技术。今后人们可以拥有个人化验室,无论在地球任何地方,随时可以对自己的健康状况进行监测。在药物筛选方面,目前国外几乎所有的主要制药公司都不同程度地采用了生物芯片技术来寻找药物靶标,查检药物的毒性或副作用。用芯片技术进行大规模的药物筛选可以省略大量的动物试验,缩短药物筛选所用时间,从而带动创新药物的研究和开发。基因芯片在环保方面的应用表现在,可高效地探测到由微生物或有机物引起的污染,还能帮助研究人员找到并合成具有解毒和消化污染物功能的天然酶基因。这种对环境友好的基因一旦被发现,研究人员将把它们转入普通的细菌中,然后用这种转基因细菌清理被污染的河流或土壤。另外生物芯片在农业、食品监督、司法鉴定等方面都将作出重大贡献。生物芯片技术的深入研究和广泛应用,将对21世纪人类生活和健康产生极其深远的影响。


《科学》:生物芯片与基因发现

最新一期《Science》发表K.K.Jain的文章Biochips for Gene Spotting,全文如下:发表生物芯片是目前生物技术中主要的技术之一。研究人员从计算机技术中借用了微型化、整合、平行化处理的技术来发展在芯片上的实验室装置和处理过程。一般地,在芯片上的靶标是有序排列的样本,如cDNA,寡核苷酸或者蛋白质等。宏观矩阵(Macroarraying)也可称之为画格子,把样本点到比较大的尼龙膜上,通过杂交来分析它们。然而,微矩阵(Microarraying)的点直径小于200微米,并需要显微分析。把那么多的信息放在一个很小的空间里使得微矩阵有明显的优势。一个微矩阵(DNA microarray)只占有几平方厘米的空间,但是包含了上千个靶点,每一个点代表了一个基因的部分。因此,在芯片上设计包含一个复杂生物体的所有基因,大约30000到60000个是可能的。

随着生物芯片技术的发展,有很多的语言来描述它。至少有23种不同的术语来描述微矩阵。最常用的是称之为“DNA芯片”(DNA chip),虽然“基因芯片”(geng chip)这个词有时也用,但是GeneChip是Affymetrix公司基因分析研究用的专利微矩阵,它能够在一片上摆放多至400000个不同的寡核苷酸片段或10000个基因的每个基因的40个片段。

DNA微矩阵系统是多用途的工具,可以用来变异分析,基因测序和基因表达分析。这些系统组合了DNA芯片和样本处理装置,用于阅读信号分子的扫描仪,分析数据的生物信息学工具等。通过与固定在芯片上的寡核苷酸杂交,可以容易地在基因组规模上来定量分析特定mRNAs的表达或检测基因组DNA的多态性。

芯片技术也可以用来分析蛋白质。如产品ProteinChip(Ciphergen biosystem Inc.,Fremont,California)能把蛋白质点阵到经化学方法或酶、受体、抗体等生物学方法处理过的固体表面。通过衡量与芯片表面的亲和力来分析未知分子,用聚焦的激光能量把它们从表面分离下来,根据分子量来检测。这样的芯片可以用来进行免疫分析,蛋白-蛋白间的相互作用和配体结合分析。这儿主要集中于讲DNA芯片的使用和不同类型的蛋白芯片。

DNA微矩阵是一种同时对上千个基因的表达进行分析的好工具。最普遍的是,微矩阵分析是通过荧光标记的cDNAs(来自RNA)与固定在芯片上的序列杂交。这儿,探针指的是荧光标记的DNAs,靶标指的是固定的序列。这些定义与传统的杂交技术中的刚好相反,所以读者需要注意。

用于基因表达的微矩阵分析包括以下几个步骤:

1)矩阵的构建。点到芯片上的DNAs可以是cDNAs(部分或完整的),基因组DNAs,或者是化学合成的寡核苷酸序列。
  2)探针的准备。从样本中抽提出RNA,反转录成cDNA。后面这一步骤包括了荧光染料整合到每个样本的探针中。
  3)探针与矩阵的杂交。来自两个样本的探针混合在一起,在芯片上都有其互补序列。就如传统的核酸杂交,杂交条件经过优化使背景最小。未结合上的探针在扫描前被冲洗掉。
  4)扫描和检测。用激光共聚焦的扫描仪来扫描杂交后的矩阵,检测用来标记探针的两种荧光染料。荧光信息存储在电脑中,并进行分析和图象建设。
  5)标准化和数据分析。对每一种染料扫描后的图象通过一定的软件处理并合并得到每个点的重叠图。点数和每点的强度定量确定,确定背景强度并被减掉。对照点,或是额外加入的序列,或是报道基因,或是每个样本的总的荧光信号强度,来帮助校正两种荧光染料的标记差异和检测效率。一般的,两个样本中的每个基因信号用控制好的强度进行扫描测量。

基于DNA矩阵的技术提供了相对简单的方法来同时测量生物体中的所有基因的差异表达,如在不同的细胞或组织样本中的RNA转录物的相对水平。当两个不同来源(对照和疾病组织)的特定RNAs的水平差异可以通过两种不同的颜色来代表,如蓝和黄。如果在两个组织中的一个基因的表达水平相同,电脑会用绿颜色表示。用蓝或绿代表颜色的变化表明基因表达有差异。用芯片技术来平行化分析基因的表达,使得我们可以来了解参予基因表达调节的细胞中的过程。DNA矩阵的信息使研究者可以来研究在滤过性病菌感染而引起的疾病状态下的或细胞转化引起肿瘤状态下的基因表达。对这些变化的更全面的了解有助于对病毒复制,发病机理和宿主抗病毒机理的了解。


微矩阵分析产生了巨大的数据组。例如,对六个样本的芯片实验,约有50000个基因,以及10个不同的实验条件产生3000000条基本数据。样本图象的交差对比分析将把此数据信息成倍翻番。这么多的数据需要大规模的信息存储,分析和管理。这样的生物数据的挖掘和存储系统近来已进入市场。软件包帮助了研究者,使他们在进行对矩阵的分析较为简单,如图象的组合、定量和转化成表达信息,以便于进一步的研究和确证。基因表达模式的分析有助于研究者对药物作用机理的研究。例如通过cDNA微矩阵来研究ferrioxamine的作用,它是酵母中的铁离子鏊合物,通过转录因子Aft1调节铁的吸收,因为铁的处理提高了Aft1的活性。这个结果说明了酵母中有两组ATF-1调节基因,它们维持了不同的ferrioxamine介导的铁离子吸收途径。高亲合性的亚铁离子转运系统中的一个组分Fet3p表达在细胞膜上;然而,Arn3p高铁离子介导转运系统表达在细胞内小泡。

在药物研发过程中高通量的基因表达分析扮演着一个重要的角色。用微矩阵,可以在基因组水平上来检测基因表达,可以确定疾病细胞的基因表达模式特征谱和鉴定潜在的药物靶标。微矩阵技术也加快了药物靶标的确认和确定二级药物靶标的效应,帮助确定药物的副作用或与其他药物的作用。

分子诊断学也是微矩阵技术应用的一个方面。随着微生物基因组序列作为特定的遗传标记,这些遗传标记点阵到玻璃片上制成DNA芯片。靶标DNA可以从临床测试标本中抽提出来,用一种荧光染料标记,然后与芯片上的基因组序列杂交。与芯片上的靶序列形成双聚体,在有探针的位置则有荧光信号。通过荧光信号确定靶标序列,因此来确定样本中是否存在这种微生物。微矩阵技术已经用来检测癌症细胞中的基因表达和检测乳腺癌中的BRCA1基因的突变。组织芯片也已发展起来,在同一芯片上可以同时分析多达1000个肿瘤样本。这一方法已经用来快速鉴定膀胱癌分子变异。

人类基因组测序工作的完成和分析序列变异的技术将促进全球的人基因的变异研究。用微矩阵技术来进行基因表达谱、基因型、突变检测和基因发现的研究,可以探知以前仅知道序列的成千个基因的功能。基于微矩阵的比较基因组学也是富有前途的,用来探索微生物感染的分子流行病学。用高密度的微矩阵寡核苷酸技术来研究Mycobacterium tuberculosis,检测小范围的基因缺失和研究与病原性减弱趋向相关的特定基因突变。

小范围的DNA的单个碱基的变异称为单核苷酸多态性,通过基因来能够区分不同的个体。把包含SNP的寡核苷酸序列固定到表面,每个序列含有一个特定的SNP。为了确定个体基因组中是否存在SNP,从个体中得到的DNA同芯片杂交。如果一个特定的SNP存在,则荧光标记的基因组探针在相应位置上显示阳性信号。如果不存在,则不显示信号。一个明显的缺点是对每个个体必须用一片微矩阵或芯片进行检测,这可能是一个大规模的昂贵的检测。

OmniScan(Poly Genyx Inc.,Worcester,Massachusetts),把多个个体的基因组而不是SNPs固定到芯片上。因此,SNP的检测通过SNPs与固体表面的靶标结合而不是基因组序列。这样允许多达10000个体的DNA固定到一片上,然后同时分析它们。这个平行化处理的手段比大群体的系列研究要有效的多。

SNP基因型和新出现的药物基因组学可能领导着大规模基因扫描和个体化诊疗,最适合个体基因型的医疗和用药。记录在一个生物芯片的个体遗传信息能够用来确定个体的疾病易感和最佳的治疗手段。在不久的将来,微芯片将作为病人手头或医生办公室手持式的诊断工具。自动的实验室设备可以扫描患者的基因组,通过计算机分析预测患者对特定药物的反应。因此,在几分钟内决定每个病人的理想治疗过程是可能的。但是在这样的技术可以使用之前,伴随着疾病遗传谱的隐私和伦理问题需要解决。

医学的一个崭新的世纪展现在我们面前。微矩阵技术因为它的扫描和检测能力将帮助人类实现全面的保健和个体化治疗。


抗体芯片——新一代的蛋白分析手段

蛋白质是一切生命活动的基础,受基因表达的调控,因而以检测样品中的mRNA为基础的cDNA芯片是当今研究中倍受关注的研究手段。但是,由于存在着转录后加工、翻译调控以及翻译后加工等多种调节机制,基因的表达,或者说mRNA的水平并不必然代表蛋白质产物的水平。因此,以微阵列技术对生物样品作整体蛋白质表达分析的蛋白芯片在后基因组时代越来越受重视。抗体芯片(Antibody Microarray,抗体微阵列),是蛋白质芯片的一种,是检测生物样品中蛋白表达模式的新方法。这种新技术使得研究人员可以在一次实验中比较生物样品中成百上千的蛋白质的相对丰度,将极大促进蛋白质组目前的研究状况——因为以现有的技术中对蛋白质进行这种复杂的分析是非常困难的。

Clontech公司第一代的抗体芯片Ab Microarray 380(Cat. No.K1847-1)包含固定在玻璃片基上的378种已知蛋白质的单克隆抗体,可以在一次简单实验中同时检测样品中的378种蛋白质的表达情况,并且可以在一张芯片上对两种样品的表达模式进行比较分析。这使得抗体芯片在毒性实验、疾病研究和药物开发上有广泛的应用前景。Ab Microarray 380芯片上每个抗体都是并列双点以增加结果的可靠性,抗体针对广泛的胞内蛋白和膜结合蛋白,已知参与信号传导、癌症、细胞周期调控、细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能,因而可以用于检测某一特定的生理或病理过程相关蛋白的表达模式。尽管抗原来自人,但很多抗体可以识别小鼠或大鼠的样品。详细的资料可以上网查询。

芯片上抗体的选择不但根据其特异性,也根据抗体的结合亲和力,在验证实验中特异性低、交叉反应高、或者信号强度低的抗体都被排除,另外所有抗体都经过检验保证得到的信号与抗原浓度有良好的线性相关,那些没有良好的线性剂量关系的抗体都被排除。因此抗体芯片能够检测到样品中很低的pg/ml浓度的抗原。

第一代的蛋白芯片和DNA芯片一样是作为一种定性分析的工具,可用于分析样品之间相关蛋白的相对表达丰度;还可以作为DNA芯片的补充,用于研究蛋白和基因表达之间的关系。

操作流程
  抗体芯片并不要求特殊的技能,只要一般常规的操作就可以完成以往极为复杂耗时的工作。整个操作流程包括:从50~200mg组织或细胞、体液中进行蛋白质抽提——用Cy5和Cy3两种不同颜色的荧光分子分别标记两个样品——洗去多余的标记分子——与芯片杂交孵育——扫描分析结果。整个过程从样品制备到结果分析只要一天即可完成,你只要准备好样品、荧光染料、脱盐纯化柱(处理体液样品时用)和荧光扫描仪,其他的试剂全部由试剂盒提供。

优化的试剂
  随芯片试剂盒提供的蛋白抽提/标记缓冲液,是专门为抗体芯片而设计的,非常温和的去垢剂在能高效抽提膜结合蛋白(相比SDS煮沸法能抽提95%以上的蛋白)的同时能保持蛋白的天然活性(非变性条件),这样能够保证抽提的蛋白的溶解性和代表性,保证以后的实验结果的真实性,和原始材料的一致性。

Internally Normalized Ratio
  根据操作手册进行内源标准化处理可以得到一个内源标准化信噪比(INR),内源标准化处理是指对两个样品(A、B)中分别用两种荧光标记分子(Cy3和Cy5)标记,并交叉与芯片杂交,可以作为消除抗原—抗体结合效率差异的对照,也可以消除潜在的不同荧光分子的标记效率差异。假如Cy5标记效率高于Cy3,单纯一个实验的结果就会有偏差(Cy5标记的样品信号偏高),用这种双向交叉反应就可以消除这种偏差。两芯片杂交结果分别得到两组Ratio值,通过免费下载的工具就可以自动算出每个抗体抗原的INR值,这就代表在两个样品间某个蛋白的相对丰度。这种内源标准化处理可以大大减小样品分析的偏差。

抗体芯片检测的结果不是蛋白的绝对含量而是378个目的蛋白在两个样品之间的相对丰度。值得注意的是由于抗体抗原结合的差异、标记差异等原因,根据芯片结果信号的强弱判断同一样品中两种不同蛋白的多少是不恰当的。


特点
  _整个分析过程可以在一天内完成
  _用荧光分析的方法比较两个样品之间378个蛋白质的相对丰度
  _适用于包括组织、细胞系、体液在内的多种生物样品
  _试剂盒提供完整的样品抽提制备、标记、孵育所需的Buffer,特别设计的样品制备的过程能保持样品的完整性和溶解性,保证制备样品具有代表性和一致性。
  _芯片上的抗体包含针对信号传导、癌症、细胞周期调控、细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能的相关蛋白,跨度大、适用范围广。
  _芯片上的抗体分别经过特异性抗原、细胞系和组织的检测,灵敏度高达pg/ml
  _开放性的芯片平台设计,可以用各种型号DNA芯片荧光扫描仪进行检测。

生物芯片:本世纪最大的产业

据人民网-市场报(李卫红):生物芯片的技术来源追朔到一个多世纪之前,EdSouthern先生发现被标记的核酸分子能够与另一被固化的核酸分子配对杂交。因此,Southernblot可被看做是最早的生物芯片。在八十年代,BainsW。等人就将短的DNA片断固定到支持物上,借助杂交方式进行序列测定。但基因芯片从实验室走向工业化却是直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入。它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行,而且借助激光共聚焦显微扫描技术使得可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析。

何为生物芯片  
  生物芯片是将生命科学研究中所涉及的不连续的分析过程(如样品制备、化学反应和分析检测),利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统,使之连续化、集成化、微型化。生物芯片技术有四大要点:芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子反应和信号的检测。

生物芯片的主要类型  
  生物芯片技术是一种高通量检测技术,它包括基因芯片、蛋白芯片及芯片实验室三大领域。 
  1、基因芯片(Gene chip)又称DNA芯片(DNA Chip)。它是在基因探针的基础上研制出的,所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列,在探针上连接一些可检测的物质,根据碱基互补的原理,利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。它将大量探针分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。 
  2、蛋白质芯片与基因芯片的基本原理相同,但它利用的不是碱基配对而是抗体与抗原结合的特异性即免疫反应来检测。蛋白质芯片构建的简化模型为:选择一种固相载体能够牢固地结合蛋白质分子(抗原或抗体),这样形成蛋白质的微阵列,即蛋白质芯片。 
  3、芯片实验室为高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统,它最终的目的是实现生化分析全过程全部集成在一片芯片上完成,从而使现有的许多烦琐、费时、不连续、不精确和难以重复的生物分析过程自动化、连续化和微缩化,属未来生物芯片的发展方向。

生物芯片的应用前景展望  
  生物芯片的成熟和应用一方面将为本世纪的疾病诊断和治疗、新药开发、分子生物学、航空航天、司法鉴定、食品卫生和环境监测等领域带来一场革命;另一方面生物芯片的出现为人类提供了能够对个体生物信息进行高速、并行采集和分析的强有力的技术手段,故必将成为未来生物信息学研究中的一个重要信息采集和处理平台。 
  关于生物芯片的市场状况,到2001年,全世界生物芯片的市场已达170亿美元,用生物芯片进行药理遗传学和药理基因组学研究所涉及的世界药物市场每年约1800亿美元。在最近的5年之内,应用生物芯片的市场销售将达到200亿美元左右。根据专家统计:全球目前生物芯片工业产值最近5年的市场销售可达到200亿美元以上。到2005年,仅美国用于基因组研究的芯片销售额将达50亿美元,2010年有可能上升为400亿美元。这还不包括用于疾病预防及诊治及其它领域中的基因芯片,这部分预计比基因组研究用量还要大上百倍。因此,基因芯片及相关产品产业将取代微电子芯片产业,成为本世纪最大的产业。


我国生物芯片的市场前景  
  1、药物筛选和新药开发:由于所有药物(或兽药)都是直接或间接地通过修饰、改变人类(或相关动物)基因的表达及表达产物的功能而生效,而芯片技术具有高通量、大规模、平行性地分析基因表达或蛋白质状况(蛋白质芯片)的能力,芯片作大规模的药物筛选研究可以省略大量的动物试验甚至临床,缩短药物筛选所用时间,提高效率,降低风险。 
  2、中药基因组学研究和我国的中药现代化:中药基因组学的含义是通过现代科学技术手段结合传统
  中药理论和现代科学理论,将中药的药性、功能及主治与其对特定疾病相关基因表达调控的影响关联起来,在分子水平上用现代基因组学,特别是功能或疾病基因组学的理论来诠释传统中药理论及作用机理。能够做到这一点,将极大地推动我国几千年悠久深厚的中药文化资源得到进一步的发展和弘扬。 
  3、疾病诊断:基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术,应用于疾病的诊断,其优点有以下几个方面:一是高度的灵敏性和准确性;二是快速简便;三是可同时检测多种疾病。 
  4、环境保护及其他:在环境保护上,基因芯片也广泛的用途,一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害,同时还可用于农业、商检、司法等领域的实用化芯片开发出来。

将生物芯片的产业化
  1、制造技术:基因芯片从实验室走向工业化却是直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入。它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行,而且借助激光共聚焦显微扫描技术使得可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析。芯片技术原理并不复杂,就其制作涉及的每项技术而言,我国已具有实际能力。芯片如何实现各种相关技术的整合集成,是我国发展生物芯片的难点。 
  2、基因、蛋白质等前沿研究:对生物芯片工业来讲,除去制作技术外,关键就是芯片上放置的基因和蛋白质等物质了。如果制作用于检测某人核苷酸多态性以诊断某种遗传病,或者用于基因测序,那么芯片探针上一般放置的是有8个碱基的寡聚核苷酸片段,基因芯片和蛋白质芯片则相应放置的是基因标志性片段EST(可表达的基因标志性cDNA序列片段,可以通过对mRNA的双端尾侧的几百个碱基进行测序得到)、全长基因或蛋白质。因此制作生物芯片首先要解决的是DNA探针、基因以及蛋白质的尽可能全面和快速的收集问题。

国内相关上市公司主要有:星湖科技、复星实业、上海医药、张江高科等。

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