生物芯片入门（五）：应用

基因芯片技术及其研究现状和应用前景

生物芯片技术是随着“人类基因组计划”（human genome project，HGP）的进展而发展起来的，它是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，它融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片、以及元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。本文主要讨论基因芯片技术，它为“后基因组计划”时期基因功能的研究提供了强有力的工具，将会使基因诊断、药物筛选、给药个性化等方面取得重大突破，该技术被评为1998年度世界十大科技进展之一。

1、基本概念

基因芯片（gene chip）也叫DNA芯片、DNA微阵列（DNA microarray）、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array），是指采用原位合成（in situ synthesis）或显微打印手段，将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测或医学诊断，由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之为基因芯片技术。

2、技术基本过程

2．1 DNA方阵的构建

选择硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物，并作相应处理，然后采用光导化学合成和照相平板印刷技术可在硅片等表面合成寡核苷酸探针；或者通过液相化学合成寡核苷酸链探针，或PCR技术扩增基因序列，再纯化、定量分析，由阵列复制器（arraying and replicating device ARD），或阵列机（arrayer）及电脑控制的机器人，准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。

2．2 样品DNA或mRNA的准备

从血液或活组织中获取的DNA/mRNA样品在标记成为探针以前必须进行扩增提高阅读灵敏度。Mosaic Technologies公司发展了一种固相PCR系统，好于传统PCR技术，他们在靶DNA上设计一对双向引物，将其排列在丙烯酰胺薄膜上，这种方法无交叉污染且省去液相处理的繁锁；Lynx Therapeutics公司提出另一个革新的方法，即大规模平行固相克隆（massively parallel solid-phase cloning）这个方法可以对一个样品中数以万计的DNA片段同时进行克隆，且不必分离和单独处理每个克隆，使样品扩增更为有效快速。

在PCR扩增过程中，必须同时进行样品标记，标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。

2．3 分子杂交

样品DNA与探针DNA互补杂交要根据探针的类型和长度以及芯片的应用来选择、优化杂交条件。如用于基因表达监测，杂交的严格性较低、低温、时间长、盐浓度高；若用于突变检测，则杂交条件相反。芯片分子杂交的特点是探针固化，样品荧光标记，一次可以对大量生物样品进行检测分析，杂交过程只要30min。美国Nangon公司采用控制电场的方式，使分子杂交速度缩到1min，甚至几秒钟。德国癌症研究院的Jorg Hoheisel等认为以肽核酸（PNA）为探针效果更好。

2．4 杂交图谱的检测和分析

用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力学稳定性低，荧光信号弱（不到前者的1/35～1/5），不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜，或落射荧光显微镜等检测到，由计算机软件处理分析，得到有关基因图谱。目前，如质谱法、化学发光法、光导纤维法等更灵敏、快速，有取代荧光法的趋势。

3、应用

3．1 测序

基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列，这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。Mark chee等用含135000个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因组序列，准确率达99%。Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差异，结果发现在外显子11约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之间，提示了二者在进化上的高度相似性。

3．2 基因表达水平的检测

用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列（其中14个为完全序列，31个为EST），检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平，用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交，经激光共聚焦显微扫描，发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异，而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。Schena等用人外周血淋巴细胞的cDNA文库构建一个代表1046个基因的cDNA微阵列，来检测体外培养的T细胞对热休克反应后不同基因表达的差异，发现有5个基因在处理后存在非常明显的高表达，11个基因中度表达增加和6个基因表达明显抑制。该结果还用荧光素交换标记对照和处理组及RNA印迹方法证实。在HGP完成之后，用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期不远了。

3．3 基因诊断

从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。例如，Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。又如，Heller等构建了96个基因的cDNA微阵，用于检测分析关节炎、风湿性关节炎（RA）相关的基因，以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用。

3．4 药物筛选

如何分离和鉴定药的有效成份是目前中药产业和传统的西药开发遇到的重大障碍，基因芯片技术是解决这一障碍的有效手段，它能够大规模地筛选、通用性强，能够从基因水平解释药物的作用机理，即可以利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。如果再用mRNA 构建cDNA表达文库，然后用得到的肽库制作肽芯片，则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。或者,利用RNA、单链DNA有很大的柔性，能形成复杂的空间结构，更有利与靶分子相结合，可将核酸库中的RNA或单链DNA固定在芯片上，然后与靶蛋白孵育，形成蛋白质-RNA或蛋白质-DNA复合物，可以筛选特异的药物蛋白或核酸，因此芯片技术和RNA库的结合在药物筛选中将得到广泛应用。在寻找HIV药物中，Jellis等用组合化学合成及DNA芯片技术筛选了654536种硫代磷酸八聚核苷酸，并从中确定了具有XXG4XX样结构的抑制物，实验表明，这种筛选物对HIV感染细胞有明显阻断作用。生物芯片技术使得药物筛选，靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高，成本大大降低。基因芯片药物筛选技术工作目前刚刚起步，美国很多制药公司已开始前期工作，即正在建立表达谱数据库，从而为药物筛选提供各种靶基因及分析手段。这一技术具有很大的潜在应用价值。

3．5 给药个性化

临床上，同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用，而对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很大。这主要是由于病人遗传学上存在差异，如药物应答基因，导致对药物产生不同的反应。例如细胞色素P450酶与大约25%广泛使用的药物的代谢有关，如果病人该酶的基因发生突变就会对降压药异喹胍产生明显的副作用，大约5%～10%的高加索人缺乏该酶基因的活性。现已弄清楚这类基因存在广泛变异，这些变异除对药物产生不同反应外，还与易犯各种疾病如肿瘤、自身免疫病和帕金森病有关。如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断，再开处方，就可对病人实施个体优化治疗。另一方面，在治疗中，很多同种疾病的具体病因是因人而异的，用药也应因人而异。例如乙肝有较多亚型，HBV基因的多个位点如S，P及C基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间就检测一次，这对指导用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。又如，现用于治疗AIDS的药物主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂，但在用药3～12月后常出现耐药，其原因是rt、pro基因产生一个或多个点突变。Rt基因四个常见突变位点是Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Phe、Tyr和Lys219→Glu四个位点均突变较单一位点突变后对药物的耐受能力成百倍增加。如将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA芯片，则可快速地检测病人是这一个或那一个或多个基因发生突变，从而可对症下药，所以对指导治疗和预后有很大的意义。

此外，基因芯片在新基因发现、药物基因组图、中药物种鉴定、DNA计算机研究等方面都有巨大应用价值。

4、基因芯片国内外现状和前景

自从1996年美国Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯片，并制作出芯片系统，此后世界各国在芯片研究方面快速前进，不断有新的突破。美国的Hyseq公司、Syntexi公司、Nanogen公司、Incyte公司及日本、欧洲各国都积极开展DNA芯片研究工作；摩托罗拉、惠普、IBM等跨国公司也相继投以巨资开展芯片研究。1998年12月Affymefrix公司和Molecular Dynamics公司宣布成立基因分析协会（Genetic Analysis Technology Consortium）以制定一个统一的技术平台生产更有效而价谦的设备，与此相呼应，英国的Amershcem Pharmacia Biotechnology公司也在同一天宣布将提供部分掌握的技术以推动这项技术的应用。美国关于芯片技术召开了两次会议，克林顿总统在会上高度赞赏和肯定该技术，将基因芯片看作是保证一生健康的指南针。预计在今后五年内生物芯片销售可达200～300亿美元；据《财富》杂志预测，在21世纪，生物芯片对人类的影响将可能超过微电子芯片。

我国在生物芯片研究方面刚刚起步，以1997香山会议以来，我国对生物芯片高度重视，1998年10月，中科院将基因芯片列为“九五”特别支持项目，利用中科院在微电子技术、生化技术、物理检测技术方面的优势，组织跨所、跨学科合作。现在以中科院上海冶金所为龙头，与上海原子核所、有机所、生化所、遗传所、肿瘤所、武汉病毒所、上海医科大学、上海市疾病检测中心、华东师大等单位组成强强联合，在微阵列芯片和基于MEBS的芯片方面有大的突破，在DNA芯片设计、基片修饰、探针固定、样品标记、杂交和检测等方面的技术都有较大的进展，已研制出肝癌基因差异表达芯片、乙肝病毒多态性检测芯片、多种恶性肿瘤病毒基因芯片等有一定实用意义的基因芯片和DNA芯片检测仪样机。中科院上海冶金所等又将在徐元森院士、赵建龙博士等带领下，决心开发重大传染性疾病的诊断芯片及检测设备，如HBV、HCV、TB三种基因诊断芯片。上海细胞所正在进行人类全套基因组的cDNA阵列和微阵列制备，为我国科研和开发提供一个技术平台，并使之产业化。同时，清华、复旦、东南大学、北京军事医学科学院、华东理工大学、第一军医大学等单位都在积极进行芯片研究。2000年国际生物芯片技术大会于10月11～14在北京召开，这又是对我国生物芯片技术有很大的促进作用。

总之，我国基因芯片研究也紧跟国际前沿，力争在此高新技术领域里有一席之地，它将对我国生命科学研究，医学诊断，新药筛选具有革命性的推动作用，也将对我国人口素质、农业发展、环境保护等作出具大的贡献，同时带动我国科学整体进步，为各相关高科技产业创造机会。基因芯片将成为21世纪最令人注目的高新技术领域之一，将使人类早日进入生物信息时代。

基因芯片在临床应用中的前景

基因芯片及其技术是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新科技，一旦被广泛应用与临床，它将在一些重症传染病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、神经性疾病等方面，发生巨大的革命性的变革，基因技术在疾病的诊断、检测及治疗用药等方面有广阔的应用、研究价值。

一、基本概念

基因芯片（gene chip），又称DNA芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后按碱基配对原理进行杂交，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。基因芯片技术具有多样品并行处理能力、分析速度快、所需样品量少、污染少等优点，近年来在临床诊断、药物筛选、指导临床用药及治疗等研究领域带来革新性的影响。

二、基因芯片的主要类型

基因芯片的类型按分类方法不同可分为不同的类型。

1、无机片基和有机合成物片基的基因芯片

以基因芯片的片基或支持物的不同可以分为无机片基和有机合成物片基，前者主要有半导体硅片和玻璃片等，其上的探针主要以原位聚合的方法合成；后者主要有特定孔径的硝酸纤维膜和尼龙膜，其上的探针主要是预先合成后通过特殊的微量点样装置或仪器滴加到片基上。另有以聚丙烯膜支持物用传统的亚磷酰胺固相法原位合成高密度探针序列。

2、原位合成和预先合成然后点样的基因芯片

以探针阵列的形式分为原位合成与预先合成然后点样两种。芯片制备的原理是利用照相平板印刷技术将探针排列的序列即阵列图"印"到支持物上，在这些阵列点上结合上专一的化学基因。原位合成主要是指光引导合成技术，该技术是照相平板印刷技术与固相合成技术、计算机技术以及分子生物学等多学科相互渗透的结果。预先合成然后点样法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的DNA 合成仪进行。合成后再用特殊的点样装置将其以较高密度分布于硝酸纤维膜或经过处理的玻片上。

3、基因表达芯片和DNA测序芯片

根据芯片的功能可分为基因表达谱芯片和DNA测序芯片两类。基因表达芯片可以将克隆到的成千上万个基因特异的探针或其cDNA片段固定在一块DNA芯片上，对来源于不同的个体（正常人与患者）、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、病变、刺激（包括不同诱导、不同治疗手段）下的细胞内mRNA或反转录后产生的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确定，同时可进一步研究基因与基因间相互作用的关系。DNA 测序芯片则是基于杂交测序发展起来的。其原理是，任何线状的单链DNA或RNA序列均可分解成一系列碱基数固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence），假如我们能把原序列所有这些错落重叠的亚序列全部检测出来，就可据此重新组建出原序列。

另外也可根据所用探针的类型不同分为cDNA微阵列（或cDNA微阵列芯片）和寡核苷酸阵列（或芯片），根据应用领域不同而制备的专用芯片如毒理学芯片（Toxchip）、病毒检测芯片（如肝炎病毒检测芯片）、P53基因检测芯片等。

又可以按生物化学反应过程分：

通常的生物化学反应过程包括三步，即样品的制备，生化反应、结果的检测和分析。可将这三步不同步骤集成为不同用途的生物芯片，所以据此可将生物芯片分为不同的类型。例如用于样品制备的生物芯片，生化反应生物芯片及各种检测用生物芯片等。

三、临床上的应用前景

1、疾病诊断

基因芯片在感染性疾病、遗传性疾病、重症传染病和恶性肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比，它可以在一张芯片同时对多个病人进行多种疾病的检测，无需机体免疫应答反应期，能及早诊断，待测样品用量小；能特异性检测病原微生物的亚型及变异；可帮助医生及患者从“系统、血管、组织和细胞层次（通常称之为'第二阶段医学'）”转变到“DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次（第三阶段医学）”上了解疾病的发生、发展过程，这些特点使得医务人员在短时间内，可以掌握大量的疾病诊断信息，这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。众所周知，肿瘤和遗传疾病发生的根本原因是由于遗传物质发生了改变，检测基因突变对于阐明肿瘤及遗传病的分子机制、疾病的早期诊断具有重要意义。目前，Affymetrix公司已开发出P53基因芯片，是将已知P53基因全长序列和已知突变的探针固定在芯片上，这将有助于恶性肿瘤的早期诊断。华盛顿大学的分子生物学系与病理系联合研究了卵巢癌中基因表达谱的变化，他们将5766个基因探针固定于芯片上，其中5376个分别选自卵巢癌、卵巢表面上皮细胞及正常卵巢的cDNA文库，另外还有342个来自EST克隆，包括一些已知确定的管家基因、细胞因子和因子受体基因、生长因子和受体基因、与细胞分裂相关的基因以及新近确定的肿瘤相关基因，找出在卵巢癌组织中过度表达的30个有GenBank收录的基因，如高表达的有CD9（GenBank录入号：M38690）、Epithelial glycoprotein （GenBank录入号：M32306）、P27（GenBank录入号：X67325）等，这证明了利用基因芯片分析复杂生物体系中分子变化的可行性。又如，Hacia等在1.28cm×1.28cm的芯片上固定了9.66×10⁴个长度为20nt的寡核苷酸探针，用于检测乳腺癌基因BRCA1的exon11（3.45 kb）中所有可能的碱基置换、插入和缺失（1～5 bp）突变。在15例患者样品中，发现有14例有基因突变，类型包括点突变、插入及缺失等；在20例对照样品中均未检出假阳性结果。又如，Heller等采用基因表达谱芯片研究了类风湿关节炎、肠炎基因的特征性表达活性，发现已知炎症相关基因，如肿瘤坏死因子、白介素和粒细胞集落刺激因子在组织中有表达。还发现一些以前未知的与炎症相关基因的表达，如人基质金属弹性蛋白酶（human matrix metallo-elastase）和黑素瘤生长刺激因子（melanoma growth stimulatory factor）。同时，与一个来自外周血基因文库的1046个cDNA克隆的阵列作这两种病变状态基因差异表达的比较，发现在类风湿关节炎组织中金属蛋白酶组织抑制物1，铁蛋白轻链和锰超氧化物歧化酶表达明显升高 。通过该研究，确定了许多基因与这两种病变的关系，为探讨基因芯片在诊断感染性疾病方面提供了新的思路。现在，肝炎病毒检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等多种芯片已面市，相信不久的将来，会有更多的基因芯片用于临床。

2、药物筛选

芯片技术具有高通量、大规模、平行性等特点可以进行新药的筛选，尤其对我国传统的中药有效成分进行筛选。基因芯片对于药物靶标的发现、多靶位同步高通量药物筛选、药物作用的分子机理、药物活性及毒性评价方面都有其它方法无可比拟的优越性，能够从基因水平解释药物的作用机理，可以用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异，国外几乎所有的主要制药公司都不同程度地采用了基因芯片技术来寻找药物靶标，查检药物的毒性或副作用。例如，Kapp U等用包含950个基因探针的基因芯片比较何杰金氏病细胞系L428及KMH2与EB病的B淋巴细胞系LGL-GK的基因表达谱，发现何杰金氏病源的细胞系中白细胞介素-13（IL-13）及白细胞介素-5（IL-5）表达异常增高，用IL-13抗体处理何杰金氏病院源细胞系可显著抑制其增殖，此发现提示，IL-13可能以自分泌形式促进何杰金氏相关细胞增殖，IL-13及其信号传导途径可能成为何杰金氏病治疗及药物筛选的新靶点。芯片用于大规模的药物筛选研究可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，这可大大节省新药开发经费，并且可对由于不良反应而放弃的药物进行重新评价，选取可适用的患者群，实现个性化治疗。Michael Wilson 等使用包含有肺结核杆菌基因组PRF的97%的序列的基因芯片，对应用抗结核杆菌药物异烟肼诱导前后表达的变化，结果证明肺结核杆菌中脂肪酸合成酶Ⅱ、FbpC、efpA、fadE23、fadE24和 基因发生改变与耐药性有关，并为新药物作用的靶目标研究及指导抑制这些靶目标试剂和药物的合成提供指导。研究各种药物对不同基因的作用，从而在剂量和成分搭配上做到精确无误。相信在不久的将来，药品说明书上的适用症和禁忌症都会改为适用基因型和禁忌基因型，使得药品更加针对不同个体的不同疾病，达到疗效更佳、副作用更小的目的。

3、指导用药及治疗方案

种族、个体等因素都会导致遗传背景的差异，临床上，同样剂量的药物对于不同患者在药物疗效与副作用方面会有很大差异，如果利用基因芯片技术对患者进行诊断再开处方，就可以对患者实施个体化治疗。疾病一般不是由单个基因引起的， 在治疗中很多同种疾病的具体病因是因人而异的，所以用药也因人而异，例如，现用于治疗ADIS的药物[8]主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂，但在用药3～12个月后常出现耐药，其原因是rt、pro基因产生一个或多个点突变，对药物的耐受能力成倍增加，如果将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA芯片，则可快速地检测患者是哪些基因发生突变，从而可对症施药，指导临床治疗和预后。传统的中医药讲究的是整体治疗观，在中药基因组学和中药化学组学中，多成分、多靶点治疗是基点，关键就是分析出成分谱与活性谱，实现精确筛选和配置，以“复方”的形式作用于致病基因组。

4、预防医学

在婴儿出生前，可用生物芯片进行有效的产前筛查和诊断，防止患有先天性疾病的婴儿出生。而在婴儿出生后，即可采用基因芯片技术来分析其基因图谱，不仅可预测出他日后可以长多高，还可预测其患某些疾病的潜在可能性有多大，以便采取预防措施。

四、前景展望

尽管基因芯片发展时间不长，迄今在医学研究实际应用中的例子还不多，但由于芯片技术与传统的杂交技术相比，有检测系统微型化，对样品的需要量非常少，效率高，能高通量检测DNA序列，更好地解释基因之间表达的相互关系及检测基因表达变化的灵敏度高等优点，基因芯片在医学上的应用前景无疑是非常广阔的。但目前基因芯片还处在研究阶段，要成为临床可以普遍采用的技术仍有一些问题急待解决，随着研究的不断深入和技术的更加完善，基因芯片一定会在生命科学研究领域发挥出其非凡的作用。基因芯片技术将为我们提供一条认识生命本质的捷径。

生物芯片技术诊断病毒性肝炎研究现状

生物芯片是指通过微加工技术和微电子技术，在固体芯片表面构建微型生化分析系统，将大量特定序列和核酸片断或蛋白有序地固定在载体上，与标记好地待检核酸或蛋白分子进行反应，通过检测荧光信号的强弱而判断样本中的靶分子数量，从而实现对化合物、核酸、蛋白质、细胞及其他生物组分的准确、快速和大信息量的筛检。它具有高度平行性、多样性、微型化和自动化的特性，以往常用的任何方法都难以与之相比较。自1996年世界第一块商品化的生物芯片问世以来，短短数年间即得到迅猛发展，目前常用的有生物芯片、蛋白质芯片和芯片实验室三大类，主要应用于蛋白质组分研究、药物筛选、疾病诊断与预测、基因表达谱分析、新基因的发现、基因突变检测及多态分析、基因组文库作图及基因测序等。这一技术在病毒性疾病的诊断及疗效评价中也得到了广泛的应用，为临床诊断、用药、疗效判定及疾病的发生、发展与转归提供可靠依据。由此可以更深入地认识病毒的分子致病基础机制，发现更多的、更有效的阻断病毒感染途径和抗病毒作用靶标，以便从分子水平制定实验诊断与临床治疗方案。兹以肝炎病毒为例就近年的研究进展简介如下：

用于病毒免疫标志物的平行检测与血清学分型

目前已发现数十种病毒可引起肝炎性损害，检测其相应的免疫标志物在人体中的存在及含量，对病因诊断与治疗意义重大。最新发展的蛋白质芯片技术原理类似于常规的酶联免疫反应原理，即将特异性抗原或抗体固定于载体，待测样本按比例稀释后与其上的抗原或抗体进行反应，在加上荧光标记的抗原或抗体，用计算机软件对荧光信号进行分析，即可获得准确的定性或定量结果。一张芯片上可分布上千甚至数万个抗原或抗体，并能标记多种载光素，使之能同时倍快速检测，且可进行病毒的血清学分型。

用于肝炎病毒的分类、分型、变异和定量检测

为遴选抗病毒药物，评价临床疗效，除生化、免疫和病理指标外，还应明确病毒的核酸结构和体液病毒核酸的含量，用DNA测序、PCR等法虽可达到目的，但技术难度和实验成本限制了其应用。基因芯片则可对所有的肝炎病毒的分型、变异、突变和病毒核酸含量进行高通量、平行检测。它将待测病毒基因（DNA或是mRNA）经体外转录、PCR、逆转录、末端标记等处理成标记有荧光分子的核酸分子，然后与芯片上的探针进行杂交，用计算机对杂交信号进行处理，依信号和强度即可得出核酸含量。这一方法简便易行，实验成本低，可为临床的准确诊断、合理用药、判定预后提供切实可信的依据。

用于病毒的耐药性突变检测

目前在肝炎的抗病毒治疗中产生的病毒耐药突变，最典型者为拉米夫定（3TC）抗HBV治疗中出现的YMDD变异。此变异发生于应用3TC半年后，作用靶位为病毒的DNA聚合酶（DNAP）通过与底物竞争结合位点以抑制HBV底逆转录和复制，同时易引起DNAP的多位点突变。基因芯片的高通量、平行检测技术针对引起YMDD变异的众多基因突变位点设计探针，将之结合于同一张芯片或与上述分型基因芯片合并，从血清样本中抽取病毒DNA，经体外扩增后与芯片探针杂交，依据杂交信号判定HBV的YMDD变异，得出是否产生耐药性的结论。

结合核酸类抗体配基筛选技术（SELEX），实现基因芯片技术对肝炎免疫应答中特异性标志物及相关蛋白质的分析

随着DNA结合蛋白研究的深入，受组合化学、抗体库和随机噬菌体肽库技术的启发，人们构建了随机核酸库并从中筛选出与靶蛋白特异结合的核酸配基，此技术称为SELEX。与蛋白类抗体相比，此配基具有许多有点：作用的靶分子范围更广，配基与靶分子的结合能力与特异性更强，动力学参数可依体外诊断条件的要求而改变，不受抗原毒性和免疫原性的限制，特异性和亲和力不受组织或样本中非靶抗原的干扰，体外人工合成实现标准化生产，合成时可随意连接其他功能基因和分子等。目前已从核酸库中筛选出各种与蛋白、核酸、小分子肽、氨基酸、有机物、金属离子等特异性结合配基，并应用于临床治疗和诊断。凡涉及抗体的诊断领域，几乎均可用核酸配基替代。选择针对肝炎免疫应答过程中特异性标志物及相关反应蛋白筛选核酸配基，人工合成后结合于固相载体，制作基因芯片，即可实现芯片技术的病毒免疫标记物及免疫应答过程中的细胞因子、细胞周期、细胞凋亡等免疫学检测。

基因芯片技术虽有诸多优点，但要成为实验室或临床可以普遍采用的技术目前尚有一些关键问题亟待解决，如如何提高芯片的特异性，简化样本制备和标记操作程序，增加信号检测的灵敏度和高度集成化样本的制备，基因扩增，核酸标记及检测仪器的研制和开发等，已成为当今国内外研究的热点。

生物芯片技术在药物R&D中的应用

1946年世界上第一台电子数字计算机ENIAC在美国Pennsylvania大学问。在随后的50年里，以美国的硅谷为摇篮，计算机技术不断飞速发展，给我们的生活带来了巨大的变革。无独有偶，1991年又是在美国硅谷，Affymax公司开始了生物芯片的研制，他们将芯片光刻技术与光化学合成技术相结合制作了寡核苷酸阵列芯片。近年来，以DNA芯片为代表的生物芯片技术，得到了迅猛发展，已有多种不同功能的生物芯片问世。目前生物芯片技术已应用于分子生物学、疾病的预防、诊断和治疗、新药开发、生物武器的研制、司法鉴定、环境污染监测和食品卫生监督等诸多领域，已成为各国学术界和工业界所瞩目并研究的一个热点。

生物芯片的概念源自于计算机芯片，狭义的生物芯片即微阵列芯片，主要包括cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列、蛋白质微阵列和小分子化合物微阵列。分析的基本单位是在一定尺寸的基片（如硅片、玻璃、塑料等）表面以点阵方式固定的一系列可寻址的识别分子，点阵中每一个点都可以视为一个传感器的探头。芯片表面固定的分子在一定的条件下与被检测物进行反应，其结果利用化学荧光法、酶标法。同位素法或电化学法显示，再用扫描仪等仪器记录，最后通过专门的计算机软件进行分析。广义的生物芯片是指能对生物成分或生物分子进行快速并行处理和分析的厘米见方的固体薄型器件，其主要种类有微阵列芯片、过滤分离芯片、介电电泳分离芯片、生化反应芯片和毛细管电泳芯片等。

随着21世纪的到来，制药公司正面临着一次严峻的市场挑战。这些公司为了保持或增强在市场上的竞争力，不得不寻求发展新的药物开发技术以提高药物发现的速度，缩短新药上市的时间，减少药物开发的成本。近年来生物芯片技术的飞速发展，引起了制药业的极大兴趣，使得生物芯片技术在药物研究与开发领域得到越来越广泛的应用，已逐渐渗入到药物研发过程中的各个步骤。本文将主要讨论生物芯片技术在药物靶点发现与药物作用机制研究、超高通量药物筛选、毒理学研究、药物基因组学研究以及药物分析中的应用。

1、生物芯片在药物靶点发现与药物作用机制研究中的应用

药物靶点发现与药物作用机制研究是生物芯片技术在药物研发中应用最为广泛的一个领域。在药物靶点发现和药物作用机制研究中所使用的生物芯片主要是指DNA芯片。在DNA芯片的表面，以微阵列的方式固定有寡核苷酸或cDNA。使用DNA 芯片可以对研究者感兴趣的基因或生物体整个基因组的基因表达进行测定。在当代药物开发过程中发现和选择合适的药物靶点是药物开发的第一步，也是药物筛选及药物定向合成的关键因素之一。人体是一个复杂的网络系统，疾病的发生和发展必然牵涉到网络中的诸多环节。当今严重威胁人类健康的心脑血管疾病、恶性肿瘤、老年性痴呆症和一些代谢紊乱疾病都是多因素作用的结果，往往不能归结于单一因素的变化。应用一些基因寻找策略如DD PCR等虽然为发现新的功能基因提供了一些线索，但还是有相当的局限性。而DNA芯片可以从疾病及药物2个角度对生物体的多个参量同时进行研究以发掘药物靶点并同时获取大量其他相关信息。因此可以说，在这种情况下，任何一元化的分析方法均不及 DNA芯片这种集成化的分析手段更具有优势。

DNA芯片在药物靶点发现与药物作用机制研究中的应用具体表现在以下几个方面。

比较正常不同组织细胞中基因的表达模式

基因的表达模式给它的功能提供了间接的信息。例如只在肾脏中表达的基因就不大可能与精神分裂症有关。一些药物的靶点是在整个身体中分布广泛的蛋白质，这类药物的不良反应往往比较大。而选择只在特异组织中才表达的蛋白作为药物筛选的靶点，可以减少药物对整体产生的不良反应，因而更引起人们的关注。例如骨质疏松症（osteoporosis）与破骨细胞（osteoclasts）的功能有关，破骨细胞可以破坏并吸收骨质，当骨质的形成与破坏出现不平衡的时候，就会导致骨质疏松症。如果破骨细胞的功能得到抑制，那么就可以控制骨质疏松症的发生和发展。利用已有的人类EST序列和DNA芯片技术，可以容易地得到只在破骨细胞中进行表达的基因如 cathepsink基因，它编码半胱氨酸蛋白酶。以cathepsink基因作为靶标，筛选对它有抑制作用的药物，就有可能得到治疗骨质疏松症的药物。但是这种方法也有其局限性，它只能得到mRNA水平的表达谱，另外组织一般由多种细胞组成，而要将这些细胞分离很困难。

研究正常组织与病理组织基因表达差异

正常组织在病变的过程中，往往伴随着基因表达模式的变化。基因表达水平的升高或降低，可能是病变的原因，也可能是病变的结果。若基因表达的变化是病变的原因，则以此基因为靶点的药物就可能逆转病变；若基因表达的变化是病变的结果，则以此基因为靶点的药物就可能减轻病变的症状。DNA芯片技术可以在病理组织与正常组织之间一次比较成千上万个基因的表达变化，找出病理组织中表达异常的基因。Heller等提取正常及诱发病变的巨噬细胞、软骨细胞系、原代软骨细胞和滑膜细胞的mRNA，用包含细胞因子、趋化因子、DNA结合蛋白及基质降解金属蛋白酶等几大类基因的cDNA芯片进行筛选，发现了数种变化明显的基因。其中除了有已知与类风湿关节炎有关的TNF，IL-1，IL-6，IL-8，G-CSF，RANTES，VCAM的基因外，还有编码基质金属弹性蛋白酶HME，IL-3，ICE，趋化因子Groα等的基因。而以前认为金属弹性蛋白酶只存在于肺泡巨噬细胞和胎盘细胞中。弹性蛋白酶可以破坏胶原纤维及组织基底膜层，它在类风湿关节炎病理组织中的出现，为治疗该病提供了新的药物靶点。

利用DNA芯片来寻找疾病相关基因的策略尤其适用于病因复杂的情况。例如，恶性肿瘤的发生常常是多基因共同作用的结果，DNA芯片技术在肿瘤细胞基因表达模式及肿瘤相关基因发掘中具有重要的作用。Wang等将一些看家基因、细胞因子及受体基因、细胞分裂相关基因及其他一些癌基因共5766个基因的cDNA探针固定在芯片上，对正常卵巢组织及卵巢癌组织的mRNA进行分析，发现二者之间30%基因表达相差2倍以上，9%相差3倍以上，其中上调较为明显的有CD9。上皮糖蛋白（ep ithelial glycoprotein）、p27及HE蛋白激酶抑制物等。这些结果不仅进一步证实了以前用其他方法获得的结果，还提供了一些新的信息。再如，Kapp 等用包含950个DNA探针的DNA芯片分析比较霍奇金病细胞系L428及KMH2与EB病毒永生化的B淋巴细胞系LGL-GK的基因表达港，发现霍奇金病源的细胞系中白细胞介素-13（IL-13）及白细胞介素-5（IL-5）表达异常增高；用IL-13抗体处理霍奇金病源的细胞系可显著抑制其增殖。此发现提示，IL-13可能以自分泌形式促进霍奇金病相关细胞增殖。IL-13及其信号转导途径可能成为霍奇金病治疗及药物筛选的新靶点。

建立模式生物细胞中的基因表达模型

采用模式生物细胞进行试验，条件容易控制，对模式生物基因表达的研究将启发人们发现和确认新的药物作用靶点。目前，已有多种模式生物（如酵母）的基因组计划已经完成。酿酒酵母（saccharomvces cerevisi ae）就是一种可用来进行药物筛选的较为理想的模式生物。它是真核生物而且基因组已全部测序，细胞繁殖快，易于培养，与哺乳动物细胞有许多共同的生化机制。现在已经发现，在酵母细胞中存在许多与人类疾病相关的基因。如人类Werner's综合征表现出早熟的特征，其细胞的生活周期变短。人类与此疾病相关的基因与酵母中编码DNA解旋酶的SGS1基因极为相似。Botstein等得到了SGS1基因突变的酵母菌株，此突变菌株生活周期变短，细胞的表型特征与患有Werner's综合征入细胞相似。已有一些研究小组根据公布的酵母基因组序列，用PCR方法扩增了酵母6000多个开放阅读框（open reading frame，ORF）片段，制成DNA芯片，在整个基因组的范围内对酵母的基因表达进行检测。

建立病原作基因的表达模型

由于病原体的基因组规模相对较小，可用包含其全部基因的DNA 芯片鉴定那些对人产生毒害作用的基因。异烟肼（isoniazid，INH）是治疗肺结核的常用药物，其治疗结核病的机制是它阻断了分枝茵酸的生物合成途径。Wilson等根据已测序的肺结核杆菌基因组序列，用PCR方法扩增了3834个ORF（占全部ORF的97%），固化在玻片上，制成检测肺结核杆菌基因表达的DNA芯片。用INH处理敏感菌株，发现除了生化途径已清楚的与分枝菌酸合成相关的一些基因转录水平发生变化外，还发现EfpA基因的表达也被诱导发生了变化，推测EfpA基因也参与了分枝菌酸的生物合成，而EfpA基因只在分枝菌属中一些致病的种类中才存在，故EfpA基因可以作为治疗结核病的新靶点。另外，分别用INH和Ethionamide处理敏感菌株，获得了相似的基因表达谱，证实了两者具有相同的作用机制。

研究药物处理细胞后基因表达变化

药物与细胞（特别是敏感细胞）相互作用，将引起细胞外部形态及内部正常代谢过程的一系列变化。其内部生理活动的变化可集中表现在其基因表达的变化上。通过测定分析药物对细胞的基因表达的影响，可推测药物的作用机制，评价药物活性及毒性，进而确证药物靶点或者发现新的药物靶点。通过DNA芯片测定药物诱导的细胞基因表达变化来进行药物筛选与研究，对那些用常规方法很难追踪监测的药物或需要很长时间才能得到药物临床实验结果时，显得尤为有用。

通过监测阳性药物处理前后组织细胞基因表达变化情况可以获得许多十分有价值的信息。首先，经药物处理后表达明显改变的基因往往与发病过程及药物作用途径密切相关，很可能是药物作用的靶点或继发事件，可作为进一步药物筛选的靶点或对已有的靶点进行验证；其次，药物处理后基因表达的改变对药物作用机制研究有一定的提示作用。

理论上讲，药物作用诱导的细胞基因表达变化应与缺失编码该药物作用靶点的基因引起的基因表达变化相似。Marton等使用含有6065个酿酒酵母的ORF的DNA芯片检测发现，由免疫抑制剂FK506诱导的的基因表达变化在缺失编码被FK506抑制的蛋白的基因变种中未观察到，但在缺失与FK506作用无关的基因变种中却视察到了。于是推测FK506除了与亲免蛋白（immunophilins）结合外还有其他被忽略的作用靶（off-target）。在实验基础上，他们提出了所谓的解码器战略（decoder strategy），即首先比较经过药物作用的野生株和缺失某些基因的变种株的基因表达谱，若二者相似，则将这种变种挑选出来，并将其与药物作用。如果突变基因所编码的蛋白质参与的生物途径受药物的影响，则药物诱导该变种的基因表达变化与药物诱导野生株基因表达变化将不同。用这种策略不仅可以确证药物作用靶，还可以发现未曾引起人们注意的作用靶，并可从这些被忽略掉的靶中推测药物的毒副作用。Cyclin依赖型激酶（cyclin-dependent kinas es，CDKs）在细胞增殖中有着重要的作用，是一种抗肿瘤药物的靶点。Gray等从2，6，9，-三取代嘌呤化合物库中筛选CDKs的抑制剂。他们将体外有活性的2种化合物flavopiridol和52（化合物代号）与酵母作用，然后用共含有260000个长度为25个碱基的一组寡聚核苷酸芯片检测酵母基因表达变化。试验结果表明，几乎所有的已知与细胞周期相关的基因表达下调。虽然flavopiridol和52体外活性相似，但他们引起的酵母基因表达的变化却有显著的差异，表明二者对酵母的作用途径是不一样的。

鬼臼亚乙苷（etoposide）是p53活化拓扑异构酶Ⅱ的抑制剂，在临床上作为一种抗肿瘤药物。Wang 等经用鬼臼亚已苷作用人成骨肉瘤细胞系U2-OS后，根据不同的时间间隔分别提取细胞mRNA，用寡核苷酸芯片测定6591条mRNA表达百的变化，发现62条mRNA表达县有变化。通过选取其中12条基因做进一步研究，发现有2条是已知的p53调控基因（WAF1/p21和PCNA），有两条是新的p53靶基因，其余的与p53无关。在实验基础上，他们提出了介导鬼臼亚乙苷诱导细胞凋亡的信号传导途径。此项研究工作使人们又多获得一种抗肿痛药物的靶点。

应用DNA芯片还可直接筛选特定的基因文库以寻找药物的作用靶点。如给酵母某一特定的呈单倍体状态的基因对应的位置上放置一个遗传标记，该标记可被DNA芯片所识别，那么通过比较药物作用前后用芯片检测整个文库的结果，便有可能获得药物作用的靶基因。研究者称此种筛选方式为haploinsufficiency drug screen。

用DNA微阵列芯片进行药物研究还存在如下一些缺点：①由于杂交样品制备复杂，采用DNA微阵列芯片很难实现高通量。②DNA微阵列芯片只能用于检测已知序列的基因。③由于灵敏度的限制，采用现存的DNA微阵列芯片难以检测到表达水平很低的基因。

除了DNA芯片外，组织芯片、蛋白质芯片和细胞芯片也在药物研究中崭露头角。最近，耶鲁大学的研究小组首次报道了真核生物蛋白质组水平的蛋白质微阵列芯片。他们表达和纯化了酵母的5800种蛋白质，并将这些蛋白质点样固定在载玻片上，制作了酵母蛋白质组微阵列芯片。他们使用这种芯片筛选能与特定蛋白质和磷脂相互作用蛋白质，发现了新的能与钙调蛋白和磷脂相互作用的蛋白质。这种蛋白质微阵列芯片可以用于筛选与蛋白质相互作用的药物，还可以用于检测蛋白质翻译后的修饰。他们的研究成果证实了制作和使用蛋白质组微阵列芯片进行功能分析检测的可行性，并向人们预示了蛋白质微阵列芯片在药物开发领域的广阔应用前景。

Zlauddin和Sabatinl发明了一种细胞微阵列芯片。他们首先将不同的质粒DNA点在玻璃片上，做成质粒DNA做阵列芯片。接着用脂质转染试剂处理该质粒DNA微阵列芯片，然后在处理好的质粒DNA微阵列上培养哺乳动物细胞。点在芯片上的质粒DNA在转染试剂的帮助下原位转染哺乳动物细胞，在质粒DNA微阵列的每一个质粒样品点的相同位置形成了转染了该质粒的细胞群。细胞因获得了外源DNA而获得了新的性状。这样，由质粒DNA芯片制成了由不同性状细胞组成的细胞做阵列芯片。他们尝试用这种细胞芯片来确证药物作用靶点，寻找能改变细胞生理状态的基因产物。这种新型细胞芯片可以用来在哺乳动物细胞内高通量筛选有可能成为候选先导分子的化合物、蛋白质或寡核苷酸。在功能基因组研究和药物开发等领域具有很大的应用潜力。

2、生物芯片作为超高通量筛选平台的应用

在过去的十几年里，随着科学的进步以及在巨大的经济利益驱使下，药物筛选技术得到了飞速的发展。在80年代中期（高通量筛选形成之初），每天只能筛选30种化合物，到90年代中期，每天可筛选1，500种化合物，而如今每天可筛选超过100，000个化合物。高速、低成本的高通量筛选已成为当今药物筛选的主流，并逐渐向超高通量方向发展。在过去的几年中，世界上著名的制药公司纷纷与以高通量药物筛选技术为核心的中小型生物科技公司结盟或合作，采用高通量或超高通量药物筛选技术进行先导物分子的筛选。要进一步提高筛选率，高通量筛选技术的各个方面均需要技术创新，这为生物芯片技术进入药物筛选领域提供了宝贵的契机。

提高药物筛选的通量，实现超高通量筛选有2 条途径：一是微型化，一是自动化。生物芯片作为一种新型技术平台，正可满足超高通量筛选微型化和自动化的需要。生物芯片技术应用于超高通量筛选有2个发展方向：一是微孔板/微阵列技术，一是微流体芯片技术。

微孔板/微陈列技术

微孔板技术的发展主要表现在板孔数的增加。目前，使用最多的是96孔及384孔板，也有人使用1536孔、3456孔、甚至9600孔板。如Oldenburg等报道了用9600孔板（0.2μl/孔）分析系统，以金属蛋白酶为靶，对组合及分离纯化的化合物库进行筛选的结果。虽然随着材料科学和加工技术的发展，微孔板技术有了长足的进步，但其发展面临着一些不易解决的困难，主要有：微量液体极易蒸发，不适于那些不能用二甲亚砜（DMSO）作溶剂的筛选方法以及受限于当今还不够完善的微量液体分配技术。

微阵列技术是将微孔板技术进一步微型化。最近，哈佛大学的研究人员开发了化合物微阵列芯片，主要用于筛选能与特定蛋白质特异性结合的化合物。他们将玻片表面进行化学处理，使其衍生化产生活性基团，然后将溶于有机溶剂中的化合物用机械手点在经处理的玻片表面，化合物与玻片表面的活性基团反应而被固定于玻片表面，这样就将不同的化合物排布成微阵列，固定在玻片表面，制成化合物微阵列芯片。随后将感兴趣的蛋白质进行荧光标记，然后与微阵列芯片上的化合物反应，经清洗后，再进行荧光检测就可以筛到能与这种蛋白质特异性结合的化合物。他们用化合物微阵列芯片进行了原理性实验，其结果表明，使用这种化合物微阵列芯片可以并行、快速地进行大规模的化合物与蛋白质的结合筛选。他们最先是将玻璃片表面进行马来酰亚胺衍生化处理，后来采用亚硫酰氯处理，都获得了成功。他们还尝试了使用这种化合物微阵列芯片进行大规模对映异构体的分型检测。加利福尼亚大学Davis分校的科学家们采用类似的方法也制造了一种化合物微阵列芯片。他们对玻琥载玻片表面进行氨基化处理，在氨基玻片上进行乙醛酰衍生化，然后将带有连接臂的配体分子点在修饰过的玻片表面。在进行化学连接反应之后，这种固定了不同小分子配体的微阵列芯片被用来进行了3种生物学检测：蛋白质结合检测、功能磷酸化检测和活细胞粘附检测。实验结果证实了化合物微阵列芯片可以帮助我们对由组合合成方法获得的大量化合物进行快速的功能分析和筛选。化合物微阵列芯片技术与基于微珠体的固相组合会成技术相结合为高通量药物筛选带来了一条新的途径，将对高通量药物筛选技术的发展产生积极的影响。

最近，出现了一种被称为芯片膜片钳（patch-on-a-chip）的新技术。在这种膜片钳芯片上加工有检测电信号的点阵，点阵中的每一个点是一个电信号记录单元，同时每个点底部与负历相通，可以吸位细胞。这样膜片钳芯片上的每一个点就可以实现传统膜片钳技术的功能。膜片钳芯片具有操作简单、快速和可实现高通量等优点，可以用于电生理研究和高通量药物筛选。位于美国圣地亚哥的AVIVA公司正在致力于此项技术的开发。

微流体芯片技术

微流体装置的发展已广泛用于生化及细胞的分析。鉴于这项技术在超高通量筛选中的巨大应用前景，吸引了众多学术界和工业界的实验室对该项技术的研究与开发。借用半导体工业中所用的光刻技术将内径在10～100μm的做通道加工在玻璃或硅片中，利用电动泵和流体的压力来控制皮、纳升级液体的流动。该技术可减少几个数量级的试剂消耗量，并能提高数据质量。它所采用的并行样品处理程序可以获得更高的筛选通量。多种类型的筛选分析方法在微流体芯片上操作的可行性（包括结合分析、酶分析和细胞分析）已得到实验论证。

Jiang等制造了2种可以用于高通量检测食物污染物和进行药物筛选的微流体装置。他们以硅为模板，采用模压和毛细管成形技术在聚酯和多聚硅氧烷二甲酯中加工激流体网络。在第1种装置的微通道中夹着一块PVDF（polyvinylidene fluoride）膜可用来结合、浓缩目标化合物，然后再直接通过质谱方法鉴定目标化合物。第2种装置被用来超滤分离本巴比妥和苯巴比妥与抗体的复合物。整个过程包括上样、清洗和解离都是连续进行的。这些微流体装置不仅可以显著降低系统死体积和所需样品量，而且与先前报道的方法相比灵敏度至少可提高1～2个数量级。

Capliper Technologies公司设计的芯片装置，将从微孔板中取样与随后进行的酶抑制剂筛选结合在一起。目前，该芯片装置已制作完成，并通过了测试。测试的化合物通过与芯片相连的硅毛细管注射入芯片中，与酶及荧光酶底物混合以使它们在主反应通道内发生相互作用。酶与荧光底物反应产生基线荧光信号。如果测试化合物抑制酶的活性，信号将会暂时性的降低，通过检测荧光信号的强度就可以测定化合物抑制酶的活性。这种装置每次进样量1～10nl，进样同期10～30s。利用这个系统，每块芯片可对几千种化合物进行筛选。目前对该系统进行改进的努力主要集中在提高系统的耐用性和将不同类型的筛选方法移植到这个平台上来。最新设计的微流体芯片将液体分发。化合物稀释与筛选分析 3者集成起来，由于减少了被视为瓶颈的芯片使用前的准备步骤，使得该系统更加方便实用。

目前，致力于开发微流体芯片技术并将其应用于药物筛选的公司有：Caliper Technologies，Orchid BioSciences，ACLARA BioSciences，Li-Cor等。

3、生物芯片在毒理学研究中的应用

对药物进行毒性评价，是药物筛选过程中十分重要的一个环节。现在毒理学家多采用鼠为模型通过动物实验来确定药物的潜在毒性。这些方法需要使用大剂量的药物，花上几年时间，花费巨大。DNA芯片技术可将药物毒性与基因表达特征联系起来，通过基因表达分析便可确定药物毒性，使得药物毒性或不期望出现的效应在临床实验前得以确认。用DNA芯片可以在一个实验中同时对成千上万个基因的表达情况进行分析，为研究化学或药物分子对生物系统的作用提供全新的线索。该技术可对单个或多个有害物质进行分析，确定化学物质在低剂量条件下的毒性，分析、推断有毒物质对不同生物的毒性可比性。如果不同类型的有毒物质所对应的基因表达诺有特征性的规律，那么，通过比较对照样品和有毒物质的基因表达谱，便可对各种不同的有毒物质进行分类，在此基础上通过进一步建立合适的生物模型系统，便可通过基因表达港变化来反映药物对人体的毒性。

已经有不少研究工作表明，利用DNA芯片预测化合物毒性和对毒性物质进行分类是可行的。Waring等用15种已知的肝毒性化合物处理大鼠。这些毒物将对肝细胞造成多种伤害，如DNA 损伤、肝硬化、肝坏死和诱发肝癌等。从大鼠肝脏中提取RNA，用DNA芯片作基因表达分析。通过将基因表达结果与组织病理分析和临床化学分析的结果进行比较，发现两者有很强的相关性。该结果表明，DNA芯片分析是一种可以用来分析药物安全性和对环境毒物进行分类的灵敏度较高的方法。在另一报道中他们用同样的15种化合物作用大鼠的肝细胞，再用DNA芯片作基因表达分析，结果显示具有相似毒性机制的化合物所获得基因表达谱具有相似性。Gerhold等给大鼠服用苯巴比妥和地塞米松等药物，使用寡核苷酸芯片，检测了大鼠肝组织中与药物代谢、毒性和能量代谢相关基因的表达。最后，通过分析基因表达变化的结果就可以推测药物代谢与毒性的情况。Bartosiewicz等则利用DNA芯片对环境毒物进行了检测。

目前已有多种较为成熟的毒理学DNA芯片继问世。美国国立环境卫生研究院分子致癌机制实验室的Barrett等人研制了一种名为ToxChip的DNA芯片，可以灵敏的检测有害化学物质对人体基因表达的作用（http://dir.niehs.nih.gov/dirlmc/lmcmain.htm）；Gene Logic公司的产品Flow-thru Chip已经试投入商业运用，可用以检测药物和毒物对生物体的影响，他们还建立了庞大的基因表达数据库，可以用于药物靶点确认和毒性预测（http://www.genelogic.com/geneexp.asp）；Syngenta公司和AstraZeneca Pharmaceuticals公司的科学家设计制作了被称为ToxBlot arrays的DNA芯片，其第代产品ToxBlot Ⅱ含有大约13000人的基因，包含了所有毒理学家感兴趣的基因家族和信号通路；美国化学工业毒物研究所（Chemical Industry Insti tute of Toxicology）中专门有一个工作小组用微阵列 技术研究一些致癌毒物对人体的作用（http://www.ciit.org/toxicogenomics/construction.html）。

4、生物芯片在药物基因组学中的应用

药物基因组学是在基因组学的基础上研究不个体对药物反应的差异以便针对不同的基因型“量身定做”药物，从而将药物的药效充分发挥而不良反应减少到最小。其优点为：①在进入临床试验前，药物基因组学可以通过化合物对基因多态性的影响挑选先导物，从而降低由于药效的不稳定导致的失败几率。②在Ⅰ期临床试验中，个体基因型可以预见基因多态性造成的药物代谢动力学差异。③由于药物作用靶蛋白的差异反映在基因多态性上，因此在Ⅱ期临床试验中，由个体基因型可以预见基因多态性造成的药效差异，由此来指导Ⅲ期临床试验。④一旦发现一种可以导致药物作用差异的蛋白，其他与之相关的蛋白可作为潜在的药物作用靶。

将DNA芯片技术应用于药物基因组学，一方面可以加速药物基因组学的发展，主要是利用DNA芯片进行基因功能及其多态性的研究，以确认与药物效应及药物吸收、代谢、排泄等相关的基因，并查明这些基因的多态性；另一方面DNA芯片利用药物基因组学的研究成果，根据基因型将人分群，以实现药物基因组学研究的目的和价值。从这两方面足以看到DNA芯片技术对药物基因组学研究的影响之大。

DNA芯片可以自动、快速地检测那些可以影响药物效应的基因（如药物代谢酶、药物作用靶和致病因子的编码基因）和决定个人对药物毒性敏感性的基因。Evans和Relling就设想了一种急性原淋巴细胞白血病药物基因组芯片，这种芯片上包括了所有可能影响急性原淋巴细胞白血病病人对化学治疗反应的基因，借助这种芯片可以根据病人的基因型对病人分群，帮助医生为每个病人选择合适的治疗药物和药物剂量。

5、生物芯片在药物分析中的应用

生物芯片在药物分析中的应用主要是指采用毛细管电泳芯片/质谱系统对化合物库、血样和尿样中的药物进行分析鉴定。毛细管电泳芯片/贡谱系统是指将毛细管电泳芯片和质谱联用的一套装置。毛细管电泳芯片进行样品的分离，而与芯片联用的质谱则有选择性的对分离成分进行检测。美国康奈尔大学的Wachs等发明了一种微型化的离子喷雾装置。这种装置适合于与基于芯片的分离装置、多孔板或带有待测样品残渣的表面联用。这种装置有两种版本，一种称为微型喷雾器，主要与毛细管电泳芯片联用；另一种称为小型喷雾器，它带有伸长的吸样毛细管，可以插入多孔板孔的底部，所以适合与多孔板联用。这种装置可以帮助人们对芯片分离所得样品或多孔板中样品进行质谱检测。来自康奈尔大学同一个实验室的Deng等将玻璃制成的毛细管电泳芯片与他们自己设计的微型离子喷雾装置连接，使用PE公司的质谱系统做检测，对多种药物的标准和血浆样品进行了分析检测。实验结果证明，使用毛细管电泳芯片/质谱系统对小分子化合物进行快速（30s）的检测是可行的。这套装置可以用来对合成的化合物库和人血浆中重要成分进行分析检测。Ramseier等用芯片毛细管电泳和使胶毛细管电泳检测尿中苯丙胺及其类似物，实验结果显示芯片毛细管电泳的方法具有更快的分高速度和更高的分离效率。Chiem等则用毛细管电泳芯片检测了血清中的茶碱。

6、结语

随着一浪高过一浪的生物芯片技术研发热潮，生物芯片技术在药物研究与开发领域的应用也将更广泛更深入。特别值得一提的是，在今天“回归自然”思潮的影响下，天然药物的开发成为一股强大的潮流，而中药又以其丰富的资源、独特的疗效、较小的不良反应引起世界的关注；同时人们也认识到，从化学合成物中筛选新药难度大、费用高、周期长，于是中药的研究与开发已成为新药研发的热点。中药现代化研究的难点就在于中药成分的复杂性和中药作用机制的复杂性。生物芯片由于具有高通量（或超高通量）、并行性、低消耗、微型化、自动化的特点，将尤其适合于中药的研究与开发。例如香港城市大学的生物芯片研究小组就利用DNA微阵列芯片研究了中药对肿瘤细胞基因表达的影响；他们还致力于开发能对中药有效成分进行分离和筛选的生物芯片系统。香港理工大学的的研究小组采用DNA芯片对中药进行基因分型，从而鉴定中药的品种。生物芯片北京国家工程研究中心采用自行研制的酵母全基因组DNA芯片，与北京大学药学院生物技术室合作研究了多种抗真菌中药的作用机制。可以预见，生物芯片技术将在中药现代化研究与开发中大显身手。

随着中国加入WTO日程的日益临近，我国的制药工业面临着知识产权保护的强大压力。加紧研究开发具有自主知识产权的药物已迫在眉睫。目前国外几乎所有的大制药公司都不约而同地采用了生物芯片技术。我国在该领域虽然起步较晚，但潜力较大，以此作为突破口，将生物芯片技术应用于创新药物的研究与开发以及中医药现代化研究将一定能够取得令人瞩目的成绩。