非编码RNA研究及实验
和元生物技术（上海）股份有限公司
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非编码RNA（Non-coding RNA）是指不编码蛋白质的RNA，包括miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA等。非编码RNA发挥功能的方式很多，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种细胞活动，主要包括基因的激活和沉默，RNA的剪接、修饰和编辑，蛋白质的翻译等。
1. miRNA：miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。
miRNA敲低：设计针对miRNA的TuD RNA封闭片段或海绵片段，再将该片段构建入病毒载体中。该载体除了可以直接瞬时转染细胞用于miRNA的敲低，也可以包装成慢病毒，用于动物水平敲低miRNA。
miRNA靶基因预测：miRNA通过碱基互补配对的方式识别靶基因的3’UTR区，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。因此，可以将目的基因的3’UTR区域构建到含luciferase的报告基因上，通过比较miRNA过表达或inhibitor 与报告基因作用检测荧光值的变化，判断miRNA对靶基因的作用。再通过对3’UTR区进行定点突变的方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
miRNA常用数据库：
· miRbase（http://www.mirbase.org）：miRbase 是由曼彻斯特大学的研究人员开发的一个在线的miRNA数据库，提供包括已发表的miRNA序列数据、注释、预测基因靶标等信息的全方位数据库，是存储miRNA信息最主要的公共数据库之一。
· TargetScan（http://www.targetscan.org/）：TargetScan是通过搜索和每条miRNA种子区域匹配的保守的8mer和7mer位点来预测靶基因。
· TarBase（http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8%2Findex）：TarBase数据库人工经历了长达10年左右的时间去搜集了实验验证过的miRNA的靶基因，包括在人、小鼠、果蝇、蠕虫和斑马鱼中的miRNA的靶基因。
· miRWalk（http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/）：miRWalkis是一个综合性数据库，提供来自人类、小鼠和大鼠的miRNA的预测信息和经过验证的位于其靶基因上的结位点。
2. lncRNA：lncRNA是长链非编码RNA（long non-coding RNA）的简称，是长度在200-100000 nt之间的RNA分子。大多数的lncRNAs在组织分化发育过程中，都具有明显的时空表达特异性；序列上保守性较低，只有约12%的lncRNA可在人类之外的其它生物中找到。
根据lncRNA在基因组上相对于蛋白编码基因的位置，可以将其分为启动子区（promoter associated）、内含子间（intronic）、双向（bidirectional）、正义链（sense）、反义链（antisense）、3’UTR区（3’UTR associated）、基因间（intergenic）这7种类型。这种位置关系对于推测lncRNA的功能有很大帮助。
lncRNA干扰：针对lncRNA设计干扰片段，再将该片段构建入病毒载体中。该载体除了可以直接瞬时转染细胞用于lncRNA的干扰，也可以包装成慢病毒，用于动物水平干扰lncRNA。
lncRNA敲除：用CRISPR/Cas9技术对lncRNA进行敲除。针对lncRNA某条片段的两端分别设计多条sgRNA序列，实现大片段删除，从而达到敲除的效果。将sgRNA序列构建入病毒载体中，再将Cas9序列装入另一载体中，随后两种病毒同时感染目的细胞进行敲除。
lncRNA靶基因寻找：方法基本类似于上面表述的miRNA双荧光素酶检测。
3. circRNA: circRNA即环形RNA（circular RNA）的简称，是一类不具有5’末端帽子和3’ 末端poly（A）尾巴、并以共价键形成环形结构的客观存在于生物体内的非编码RNA分子。
circRNA主要特征：
circRNA的作用机制：
circRNA干扰：同上述的lncRNA方法步骤。
circRNA敲除：同上述的lncRNA方法步骤。
circRNA靶基因寻找：同上述的miRNA和lncRNA双荧光素酶检测方法。
和元生物的优势：
1. miRNA：miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。
图一 miRNA成熟及作用方式（Mikhailidis DP, Athyros VG. Nat Rev Cardiol. 2014 Feb;11(2):72-4.）
miRNA过表达：将miRNA前体序列构建入病毒载体中，该载体既可用于瞬时转染细胞，也可以包装成病毒用于稳定株筛选和动物水平过表达miRNA。miRNA敲低：设计针对miRNA的TuD RNA封闭片段或海绵片段，再将该片段构建入病毒载体中。该载体除了可以直接瞬时转染细胞用于miRNA的敲低，也可以包装成慢病毒，用于动物水平敲低miRNA。
miRNA靶基因预测：miRNA通过碱基互补配对的方式识别靶基因的3’UTR区，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。因此，可以将目的基因的3’UTR区域构建到含luciferase的报告基因上，通过比较miRNA过表达或inhibitor 与报告基因作用检测荧光值的变化，判断miRNA对靶基因的作用。再通过对3’UTR区进行定点突变的方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
miRNA常用数据库：
· miRbase（http://www.mirbase.org）：miRbase 是由曼彻斯特大学的研究人员开发的一个在线的miRNA数据库，提供包括已发表的miRNA序列数据、注释、预测基因靶标等信息的全方位数据库，是存储miRNA信息最主要的公共数据库之一。
· TargetScan（http://www.targetscan.org/）：TargetScan是通过搜索和每条miRNA种子区域匹配的保守的8mer和7mer位点来预测靶基因。
· TarBase（http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8%2Findex）：TarBase数据库人工经历了长达10年左右的时间去搜集了实验验证过的miRNA的靶基因，包括在人、小鼠、果蝇、蠕虫和斑马鱼中的miRNA的靶基因。
· miRWalk（http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/）：miRWalkis是一个综合性数据库，提供来自人类、小鼠和大鼠的miRNA的预测信息和经过验证的位于其靶基因上的结位点。
2. lncRNA：lncRNA是长链非编码RNA（long non-coding RNA）的简称，是长度在200-100000 nt之间的RNA分子。大多数的lncRNAs在组织分化发育过程中，都具有明显的时空表达特异性；序列上保守性较低，只有约12%的lncRNA可在人类之外的其它生物中找到。
根据lncRNA在基因组上相对于蛋白编码基因的位置，可以将其分为启动子区（promoter associated）、内含子间（intronic）、双向（bidirectional）、正义链（sense）、反义链（antisense）、3’UTR区（3’UTR associated）、基因间（intergenic）这7种类型。这种位置关系对于推测lncRNA的功能有很大帮助。
图二 lncRNA分类（Huang X, et al.Cancer Lett. 2018 Jan 28;413:94-101.）
一般来说，lncRNA主要从以下三种层面实现对基因表达的调控：
- 表观遗传学调控：lncRNA招募染色质重构复合体到特定位点进而介导相关基因的表达沉默。
- 转录调控：包括如下几种：1）lncRNA的转录能够干扰临近基因的表达；2）lncRNA能够通过封阻启动子区域来干扰基因的表达；3）lncRNA能够与RNA结合蛋白作用，并将其定位到基因启动子区从而调控基因的表达；4）lncRNA能够调节转录因子的活性；5）lncRNA也能够通过调节基本转录因子来实现调控基因的表达。
- 转录后调控：lncRNA能够在转录后水平通过与mRNA形成双链的形式调控基因的表达。
lncRNA干扰：针对lncRNA设计干扰片段，再将该片段构建入病毒载体中。该载体除了可以直接瞬时转染细胞用于lncRNA的干扰，也可以包装成慢病毒，用于动物水平干扰lncRNA。
lncRNA敲除：用CRISPR/Cas9技术对lncRNA进行敲除。针对lncRNA某条片段的两端分别设计多条sgRNA序列，实现大片段删除，从而达到敲除的效果。将sgRNA序列构建入病毒载体中，再将Cas9序列装入另一载体中，随后两种病毒同时感染目的细胞进行敲除。
lncRNA靶基因寻找：方法基本类似于上面表述的miRNA双荧光素酶检测。
3. circRNA: circRNA即环形RNA（circular RNA）的简称，是一类不具有5’末端帽子和3’ 末端poly（A）尾巴、并以共价键形成环形结构的客观存在于生物体内的非编码RNA分子。
circRNA主要特征：
- circRNA由特殊可变剪切产生，大量存在与真核细胞的细胞质中，主要来源于外显子，少部分内含子来源的circRNA存在细胞核中。
- 表达水平具有种属、组织、时间特异性。
- circRNA呈闭合环状结构，不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更加稳定。
- 具有一定序列保守性。
- 在转录或转录后水平发挥调控作用。
- 绝大多数circRNA是非编码的，但也有少数可以翻译为多肽。
circRNA的作用机制：
- miRNA分子海绵，circRNA含有大量的miRNA结合位点，具有miRNA海绵作用，进而间接调控miRNA下游靶基因的表达。
图三 miRNA海绵机制（图片来自网络）
- 调控基因转录，circRNA也可以通过与RNA结合蛋白的结合来调控蛋白功能，比如通过与转录因子的结合来抑制基因的转录。
- 编码功能，circRNA虽然属于非编码RNA，但是也有少数circRNA可以编码多肽，通过该多肽行使调控功能。
circRNA干扰：同上述的lncRNA方法步骤。
circRNA敲除：同上述的lncRNA方法步骤。
circRNA靶基因寻找：同上述的miRNA和lncRNA双荧光素酶检测方法。
和元生物的优势：
- 项目经验丰富，成功率高；
- 价格优惠，享受折扣；
- 实验周期短；
- 完善的售后服务。
| 服务内容 | 服务形式一 | 服务形式二 |
| 整体课题外包服务 | ||
| miRNA过表达 | 质粒构建 | 慢病毒/腺相关病毒/腺病毒 |
| miRNA干扰 | 质粒构建 | 慢病毒/腺相关病毒/腺病毒 |
| lncRNA过表达 | 质粒构建 | 慢病毒/腺相关病毒/腺病毒 |
| lncRNA干扰 | 质粒构建 | 慢病毒/腺相关病毒/腺病毒 |
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| circRNA过表达 | 质粒构建 | 慢病毒/腺相关病毒/腺病毒 |
| circRNA干扰 | 质粒构建 | 慢病毒/腺相关病毒/腺病毒 |
| circRNA敲除 | 质粒构建 | 慢病毒/腺相关病毒/腺病毒 |
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