scATAC-seq：原理与实验流程大起底
上海烈冰生物医药科技有限公司
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scATAC-seq作为ATAC-seq的进阶版，能够区分实验样本的细胞类型，细胞分化过程开放性染色质有什么差异，调控了哪些信号通路等等。总的来说，scATAC-seq能在基因组水平上帮助我们了解细胞的转录调控过程，揭示不同调控因子位点，从表观遗传学的角度来解析基因信息。scATAC-seq在开放染色质图谱绘制，细胞分化发育，疾病的致病机制，肿瘤微环境、生物标志物等方面具有极大的应用前景。
要了解scATAC-seq，首先我们要知道什么是ATAC-seq。ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing）是利用转座酶研究染色质可及性的高通量测序技术，通俗来说就是基于染色质可及性的特点，将携带测序信息的Tn5转座酶插入染色质中，由于转座酶只能剪切染色质开放区域并标记DNA序列，再进行高通量测序就能获得相关基因信息。
什么是染色质可及性？
正常情况下，DNA与核小体缠绕折叠在一起形成染色质，但是DNA的复制、转录都需要将染色体的高级结构解开，然而解压并不需要打开全部染色体，只需要打开表达基因的区域，这部分打开的染色质，就叫开放染色质（open chromatin）。打开染色质，允许部分调控蛋白（比如转录因子和辅因子）与之相结合的特性，即染色质的可及性（chromatin accessibility）。
对染色质可及性探究的方法有很多，比如DNase-seq，MNase-seq，ChIP-seq，FAIRE-seq等。DNase-seq和MNase-seq方法利用限制性酶对染色质DNA进行片段化处理，该方法不能获得完整开放的染色质信息。相较于粗暴的核酸酶，ScATAC-seq利用的Tn5转座酶没有偏好性，它能够完整地将整个开放区域的序列直接捕获下来，所需的细胞数量少(最少500个起始细胞），能够在短时间内使用微量样本获得大量有效信息，且灵敏度高、实验的重复性较好。
scATAC-seq能做什么?
ATAC-seq是把所有实验细胞看作了一个整体，获得所有细胞混合的基因信息。scATAC-seq是在ATAC-seq的基础上，进行细胞核的分选和标记，通过barcode识别细胞核，解决了不同细胞群体的异质性的问题，能够检测出混杂样品测序所无法得到的异质性信息。相较于ATAC-seq，scATAC-seq在细胞核的捕获和标记方面，通过带有特定barcode标签的凝胶磁珠（beads）来标记细胞核。横向孔道中输入beads，第一列输入细胞核，细胞核和beads吸附结合后在微流控作用下向右移动，进入第二列输入的油滴中，形成油包水的结构。这时候，一个液滴=一个beads=一个细胞核=一个ATAC-seq，对酶切后的短片段进行PCR扩增反应。最后去除油滴，所有的序列混合在一起，进行上机测序。
scATAC-seq实验流程
总的来说，scATAC-Seq实验流程包括：制备单细胞悬液→细胞破碎提核→单细胞核分选→文库构建→上机测序。具体实验流程如下：
样本：一般为单细胞悬液（活性＞80%），或直接提供新鲜组织样本和冻存组织样本。
提核：利用表面活性剂破坏样本细胞膜进行细胞核提取，然后使用带标签的Tn5转座酶切割开放染色质。
具体操作如下：
利用表面活性剂裂解细胞膜结构和细胞器。
去除细胞膜碎片，组织碎片。
清洗，离心，收集。
核悬浮液在转座酶混合物中孵育获得带有特定序列的染色质碎片。
单细胞核分选：10×Geomics ChromiumTM系统对每个细胞核进行捕获和标记。
建库及测序：完成文库构建，并采用Illumina高通量测序仪器进行测序，获得测序数据。
要了解scATAC-seq，首先我们要知道什么是ATAC-seq。ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing）是利用转座酶研究染色质可及性的高通量测序技术，通俗来说就是基于染色质可及性的特点，将携带测序信息的Tn5转座酶插入染色质中，由于转座酶只能剪切染色质开放区域并标记DNA序列，再进行高通量测序就能获得相关基因信息。
什么是染色质可及性？
正常情况下，DNA与核小体缠绕折叠在一起形成染色质，但是DNA的复制、转录都需要将染色体的高级结构解开，然而解压并不需要打开全部染色体，只需要打开表达基因的区域，这部分打开的染色质，就叫开放染色质（open chromatin）。打开染色质，允许部分调控蛋白（比如转录因子和辅因子）与之相结合的特性，即染色质的可及性（chromatin accessibility）。
对染色质可及性探究的方法有很多，比如DNase-seq，MNase-seq，ChIP-seq，FAIRE-seq等。DNase-seq和MNase-seq方法利用限制性酶对染色质DNA进行片段化处理，该方法不能获得完整开放的染色质信息。相较于粗暴的核酸酶，ScATAC-seq利用的Tn5转座酶没有偏好性，它能够完整地将整个开放区域的序列直接捕获下来，所需的细胞数量少(最少500个起始细胞），能够在短时间内使用微量样本获得大量有效信息，且灵敏度高、实验的重复性较好。
scATAC-seq能做什么?
ATAC-seq是把所有实验细胞看作了一个整体，获得所有细胞混合的基因信息。scATAC-seq是在ATAC-seq的基础上，进行细胞核的分选和标记，通过barcode识别细胞核，解决了不同细胞群体的异质性的问题，能够检测出混杂样品测序所无法得到的异质性信息。相较于ATAC-seq，scATAC-seq在细胞核的捕获和标记方面，通过带有特定barcode标签的凝胶磁珠（beads）来标记细胞核。横向孔道中输入beads，第一列输入细胞核，细胞核和beads吸附结合后在微流控作用下向右移动，进入第二列输入的油滴中，形成油包水的结构。这时候，一个液滴=一个beads=一个细胞核=一个ATAC-seq，对酶切后的短片段进行PCR扩增反应。最后去除油滴，所有的序列混合在一起，进行上机测序。
scATAC-seq实验流程
总的来说，scATAC-Seq实验流程包括：制备单细胞悬液→细胞破碎提核→单细胞核分选→文库构建→上机测序。具体实验流程如下：
样本：一般为单细胞悬液（活性＞80%），或直接提供新鲜组织样本和冻存组织样本。
提核：利用表面活性剂破坏样本细胞膜进行细胞核提取，然后使用带标签的Tn5转座酶切割开放染色质。
具体操作如下：
利用表面活性剂裂解细胞膜结构和细胞器。
去除细胞膜碎片，组织碎片。
清洗，离心，收集。
核悬浮液在转座酶混合物中孵育获得带有特定序列的染色质碎片。
单细胞核分选：10×Geomics ChromiumTM系统对每个细胞核进行捕获和标记。
建库及测序：完成文库构建，并采用Illumina高通量测序仪器进行测序，获得测序数据。
