🔥 单核 RNA 测序（snRNA-seq）

提取样本单细胞核后，分离并标记细胞核，在单细胞水平检测核基因表达情况的技术。

从冻存的组织中用表面活性剂与 Dounce 匀浆提取出所有细胞的细胞核，再通过组织特异性 marker 进行流式或磁珠分选选出待研究的单细胞核，然后通过二代测序系统对每个细胞核内的 RNA 进行测序，并进行后续分析。

为一些复杂或珍稀冻存样品（如脑、心脏、肾脏等）提供单细胞水平研究应用平台。

仪器：

离心机、磁珠匀浆器、Dounce 匀浆器

超声破碎仪、细胞筛（40 μm 和 20 μm）

10× 单细胞测序平台仪器

试剂：

裂解缓冲液、细胞核储存缓冲液

洋地黄皂苷、10× 单细胞测序平台试剂

一、细胞核的提取步骤

1、配制裂解缓冲液（320 mM 蔗糖，10 mM Tris-HCl pH = 8，5 mM CaCl₂，5 mM 醋酸镁，2 mM EDTA，0.5 mM EGTA，1 mM DTT，1× complete 蛋白酶抑制剂）；配制细胞核储存缓冲液（440 mM 蔗糖，10 mM Tris-HCl pH = 7.2，70 mM KCl，5 mM MgCl₂，1.5 mM 亚精胺，1 mM DTT，1× complete 蛋白酶抑制剂）。

2、将冷冻的待测组织在冰上解冻并切成片，然后在冰冷的 PBS 缓冲液中洗涤一次。

3、细胞悬液 50 g 离心 2 min 收集细胞，加入 2 mL 裂解缓冲液重悬细胞。

4、用磁珠匀浆器 5000 rpm 20 s 轻微粉碎细胞。

5、1 mL 悬浮的细胞中加入 10 μL 4.5 mg/mL 洋地黄皂苷，4 ℃ 孵育 30 min。半渗透孵育后，转移到 7 mL Dounce 匀浆器中。为了进一步破坏组织和细胞并释放细胞核，先用宽松的「A」杵匀浆 30 下，然后用紧的「B」杵匀浆 30 下。

6、超声破碎：将声波参数调至 100% 放大信号（130 W），20 秒（5 秒声波/ 5 秒间隔）。

7、100 g，4 ℃ 离心 5 min，将未破碎的细胞、组织和大的细胞碎片去除。

8、将上清液分别通过 40 μm 和 20 μm 细胞筛过滤。

9、将滤液转移到离心管中，将分离出的细胞核在 2000 g，4 ℃ 离心 10 min。

10、细胞核用 5 mL 细胞核储存缓冲液洗涤两次，2000 g，4 ℃ 离心 10 min（可置冰上保存 12 h）。本步骤也可以直接购买特定组织解离的试剂盒可直接从新鲜的组织中解离单细胞核（如心脏细胞解离试剂盒：Miltenyi Biotec, 130-098-373）。

二、单细胞核和单细胞 RNA-seq（10× 平台）流程

此过程的详细技术原理见你要送去测序的技术公司，他们会对你的待测样品有一定的要求，并会提供实验设计过程。一般你只提供步骤一中的纯化样品公司做分选与测序。

如：http://www.merrybio.com.cn/blog/10xGenomics-single-cell-RNA-sequencing.html。

1、油包水悬液制备及逆转录。

2、逆转录后 cDNA 纯化及扩增。

3、核酸片段筛选及 cDNA 定量、质控。

4、文库构建，并做质控与定量。

5、上机测序。

三、测序数据下游分析（生信软件分析）流程

这里要会一些生信代码的使用，可用软件很多，只举例一些常用的。

1、质量控制：cellranger mkfastqc

2、比对与计数：cellranger count

3、降维与聚类：seurat

4、下游可根据自己的实验目的做进一步分析：轨迹分析、细胞类型注释、细胞间相互作用、基因调节网络等分析。

对于核 RNA 测序，质量控制不论在上游实验设计还是下游数据分析都非常重要，一定要根据自己的实验目的对样品与数据进行筛选。