🔥 乙酰化 RNA 的测序

RNA 乙酰化是指在 RNA ac4C 修饰酶作用下，RNA 的 N4 位乙酰胞嘧啶发生乙酰化。ac4C RNA 乙酰化修饰是一类新型 RNA 修饰，利用 RNA 乙酰化测序可检测 RNA 的乙酰化程度和表达水平，从而探究 RNA 乙酰化修饰的生物学意义及其在疾病中的功能。

为抗病毒药物的开发研究及疾病治疗提供新的方向和分子靶。

实验样品、Trizol、无核酸酶水、无水乙醇、氯仿、1.5 ml 离心管，RNA 提取试剂盒，GenSeq® ac4C RIP 试剂盒，Nanodrop2000 核酸检测仪，Nanopore 核酸检测仪等。

实验的具体步骤：RNA 提取，RNA 片段化，RNA 片段化验证，特异性抗体孵育，免疫沉淀反应，RNA 纯化，文库制备及质检，上机测序。

1、RNA 提取

可以使用试剂盒提取或用 Trizol 法提取，步骤如下：样品中加入 1 ml Trizol；摩天轮最大转速震荡 5 min，使其充分裂解；加入 200 μl 氯仿；振荡混匀后室温放置 5 min 后；4 ℃，12 000 rpm 离心 15 min；吸取上层水相，至新离心管中；加 0.5 ml 异丙醇，50μl 3M 醋酸钠（pH5.2），-20 ℃ 放置 30 min 以上；随后 4 ℃，16 000 g 离心 30 min，这时可见白色片状沉淀；弃上清，加 1 ml 75% 乙醇洗涤沉淀；4℃，16 000 g 离心 5 min，弃上清；室温晾干或真空干燥 5~10 min，加 30~50 μl 无核酸酶水溶解 RNA 后测浓度备用（OD 260/280 及 OD 260/230 比值）。

2、RNA 片段化

① 用无酶水将 RNA 浓度调至 1 μg/μl；向 200 μl PCR 管加 18 μl RNA（冰上放置待用），进行 RNA 片段化，在离心管中加 2 μl 10 × Fragmentation Buffer，混匀并短暂离心；把 PCR 管预热至 70 ℃，6 min；反应完成取下 PCR 管，加入 2 µl Stop Buffer，混匀并短暂离心，置于冰上；将所需样品 RNA 片段化；

② 将样品的反应液合并，并转移到新的 1.5 ml EP 管中，无酶水调整总体积至 270 µl；加入 30 µl 3 M 醋酸钠（pH5.2），1 µl 糖原，750 µl 无水乙醇，轻柔混匀，−20 ℃ 或−80 ℃ 沉淀过夜后；冷冻离心机 4 ℃，16 000 g，离心 30 min；弃上清液；加入 1 ml 75% 乙醇洗涤沉淀；随后 4 ℃，16 000 g，离心 5 min，弃上清，不要触碰 RNA 沉淀；打开管盖干燥 5 min，让乙醇挥发；加入 50 μl 无酶水使 RNA 沉淀充分溶解，放置于冰上备用。 

3、RNA 片段化验证

采用 Nanodrop 荧光分光光度计测量片段化 RNA 浓度，取 0.5 μg RNA 在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳来检测 RNA 片段大小分布。取出 3 μg 片段化 RNA 作为 input 组，−80 ℃ 保存备用。剩余的片段化 RNA 用于后续实验。

4、特异性抗体孵育

用移液器轻柔吹打 PGM 磁珠使之充分重悬。加入 1 × IP Buffer 清洗磁珠，离心管放置在磁力架上直到溶液澄清弃上清液（重复洗涤）；每管中加入 50 µL 1 × IP buffer，轻柔混匀。加入 2 µl ac4C 抗体。置于 4 ℃ 孵育 4~6 h 或室温旋转孵育 1 h；短暂离心，将溶液收集至管底。将离心管放置在磁力架上直到溶液澄清（约 2 min）弃上清液，勿搅动磁珠。1 × IP buffer 洗涤磁珠：冰上放置待用。

5、免疫沉淀反应

抗体-磁珠混合物加入 RNA 片段、5 × 沉淀缓冲液和 Nuclease-free Water，4 ℃ 旋转混匀仪或万向摇床旋转孵育 1 h。用 1 × IP buffer 洗涤磁珠两次。

6、RNA 纯化

加 30 µl RLT Buffer 重悬磁珠，室温孵育 2 分钟。置于磁力架上直到溶液澄清（约 2 min）；将上清液移到新 1.5 ml 离心管中冰上备用。轻柔吹打混匀 MS 磁珠重悬。准备新 1.5 ml EP 管，并转移 20 µl MS 磁珠到新管中。置于磁力架上，至溶液澄清（约 2 min）。吸弃上清液，勿搅动 MS 磁珠。加 100 µl RLT Buffer 完全重悬 MS 磁珠。 置于磁力架上直到溶液澄清弃上清液，加 30 µl RLT Buffer 重悬 MS 磁珠，加入到冰上备用的上清液中，用 60 μl 无水乙醇，轻柔混匀，室温孵育 1 min。置于磁力架上直到溶液澄清弃上清液，加新鲜配置的 75% 乙醇清洗 MS 磁珠（重复清洗），室温干燥 5 min。加 11.25 µl 无酶水完全重悬，室温孵育 2 min。置于磁力架上直到溶液澄清。将 10 µl 的上清（洗脱的 RNA）转移到新离心管中。RNA 样品立即用于后续实验或−80 ℃ 保存待用。

7、文库制备及质检

EpiTM mini longRNA-seq 试剂盒制备文库，使用 Bioptic Qsep100 Analyzer 对文库进行质检，检测文库大小分布是否符合理论大小。

8、上机测序

采用 NovaSeq 的高通量测序平台，PE150 测序模式进行测序。

1、提取 RNA 时，不可以用漩涡振荡器，避免 RNA 断裂。

2、提取 RNA 加氯仿后，蛋白质存在于下层有机相，DNA 存在于中间层，RNA 在上层水相中，吸取上清时不要将中间层的 DNA 和下层有机相中的蛋白吸取到，避免造成污染。

3、Nanodrop2000 核酸检测仪测 RNA 浓度，要看 OD A260/A280 值与 OD A260/A230 值。

4、RNA 易降解，操作过程中要带好手套和口罩，所有仪器使用前最好用 RNA 去除剂擦一遍，消毒避免污染。

5、PCR 产物长度需要控制在 200 bp 以下。

6、要平行测序一个对照（Input）样本进行比较。