活细胞实时动态成像仪 让科研更轻松
&典奥生物
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目前，大部分的细胞检测方法采用的仍然是传统的终点法——仅仅给出最终结果，而且往往需要标记细胞和破坏细胞。这种方法无法得到细胞在生长时的真正状态，也无法对细胞的生长过程做出动态的监测和分析。美国 Essen 公司开发了第二代长时间实时动态活细胞成像分析仪——IncuCyte ZOOM，用一种非侵入式的方法，记录活细胞的实时生长状态，并在成像的同时进行定量分析。这种成像方法，被称为“定量实时细胞成像”（Quantitative Live-cell Imaging），无需设置实验终点，细胞在培养的同时进行实时成像和定量分析，并提供多种应用模块，可远程控制，扩充了用户记录和理解细胞形态、细胞生长和细胞行为的途径。
美国 Essen 公司的 IncuCyte ZOOM 是长时间、实时动态、非伤害式的活细胞成像分析平台。仪器分为显微成像器和控制器两部分，显微成像器可放置于培养箱中，中间放置多种规格尺寸的标准耗材（板、皿、瓶及载玻片均可），在其下方有显微照相设备，通过自动对焦、自动拍摄，对培养细胞进行连续的监测，并通过联网的电脑进行远程控制、数据读取与分析。系统可自动收集每个时间点的相差图像和红/绿荧光图像。用户除了可以得到各种格式的图像或动态录像外，还可以得到由系统软件自动依据覆盖度（Confluence，也翻译成融合度、饱和度）和计数分析（Cell Count）生成的基于图像数据的图表，以显示细胞的变化及趋势。如显示细胞增殖的覆盖度 vs 时间图表，显示划痕实验的相对伤口密度 vs 时间图表，显示新生血管的血管长度 vs 时间图表，或显示神经生长的神经突长度 vs 时间图表。
IncuCyte 物镜可选择 4×，10×，20×，可由用户自行更换。在4倍物镜下对 6-384 孔微孔板均可进行全孔成像。安装物镜的接头还可安装记号笔（Marking Tool），用软件操作，即可在容器底部进行物理标记，方便后续实验观察，见图 2。
图 1：培养箱中的 IncuCyte ZOOM
图 2：上左图：软件标记，上右图：用记号笔在培养皿底部进行物理标记，下图：记号笔和物镜
IncuCyte 的优势如下：
1）培养的细胞用高清晰度相差显微镜或荧光显微镜直接监测，为非破坏性的监测，细胞不用染色便可以观察监测，影像效果好；
2）培养环境由商用培养箱提供，监测过程中细胞无需离开培养箱，不用担心培养条件的改变对细胞的影响；
3）真正的长时间的动态活细胞成像，可达数周或数月；
4）高清晰度相差成像能消除微孔板的弯液面缺陷，且没有传统显微系统的光晕问题，可以在 384 微孔板内监测细胞形态；
5）图像处理软件自动依据覆盖度和计数分析，量化细胞增殖，自动输出细胞生长曲线和 IC50、EC50 值；
6）实时监控，可改变传统的“终点法”实验方法，数据丰富，更准确、更灵活；
7）高通量，可同时监测6块标准规格的细胞培养板/皿/瓶，细胞在 384 微孔板内实验，可以减少宝贵的药品消耗，见图 3；
8）支持超过 200 种的标准培养容器，无需特殊的培养容器，节约后期实验成本；
9）可远程监控，进行数据读取和分析，无需反复出入细胞房，避免了潜在的污染隐患及人工出入观测之麻烦。
图3：IncuCyte 内部结构，支持超过 200 种标准培养容器，可同时观察多达6块微孔板
图 4 是IncuCyte 记录的细胞增殖的高清晰度相差图像和覆盖度vs.时间的增殖曲线，黄色为软件对细胞图像的分割显示。IncuCyte 也可对荧光图像生成细胞数目 vs.时间的增殖曲线。最后图像会被导出成单独的 JPEG 文件或视频。
图 4：IncuCyte 记录的细胞的相差图像和增殖曲线
IncuCyte 的主要软件功能：
1）用户可以在任何一台联网的计算机上操控仪器，而无需反复拿进拿出标本及出入细胞房，这使 IncuCyte 成为了一个“虚拟的培养箱”。
2）IncuCyte 最好的特点之一就是直观的软件界面设计。用户可以在软件的操作界面上定义耗材的类型、拍摄的时间、位置及视野个数，见图 5。
3）支持在长时间拍摄过程中插入其他拍摄任务继续进行拍摄，以充分利用仪器。
4）IncuCyte 可以自动对焦，自动进行图像收集。对得到的图像也可以进行亮度、尺寸、对比度的显示控制。可以设置细胞尺寸、偏心率等参数，过滤背景杂质。
5）用户可以自定义样本信息，进行分组分析，并可以电子化标记器皿，设定关键词，必要时可用设定的关键词搜索数据库，方便查询过去任何时间得到的图像和数据。
6）用户还可以直接从软件中抓取图像、图表、曲线至 Word、Excel、PowerPoint 和 Email 中。生成的所有数据均可存档，并且数据和图表可以打包封存，便于用户带回家分析。
7）IncuCyte ZOOM 的新特性包括多荧光图像处理模块和新的相差成像处理模块。
8）ZOOM 还设计了新的数据库，使用户能更容易查找和检索实验数据。
图 5：软件操作界面
IncuCyte 的基础应用包括（无需套件）：
1）监测细胞增殖（Proliferation）：通过实时动态成像，对细胞增殖进行非侵入性的、定量的分析；
2）细胞培养质控（Cell Culture QC）/细胞培养优化（Cell Culture Optimization）：通过实时动态成像，可生成基于细胞覆盖度和细胞个数的动态生长曲线；
3）监测细胞毒性（Cytotoxicity）：将染料和细胞混合然后监测，操作者可离开，是基于染料的实验；
4）监测细胞凋亡（Apoptosis）：将凋亡试剂和细胞混合然后监测，操作者可离开，是基于染料的实验；
5）监测报告基因（Reporter Gene）：用荧光蛋白标记细胞，细胞无需裂解，可获得实时动态数据；
6）监测干细胞生长及重编程（Stem Cell Monitoring & Reprogramming）：可实时监测干细胞生长的全过程及重编程现象；
7）稀释克隆（Dilution Cloning）：可实时跟踪单细胞生长成克隆的全过程；
8）三维肿瘤球体成像（3D-Spheroid）：可自动计算 3D 肿瘤球体的生长和收缩，实时动态地定量球体参数；
9）免疫细胞杀伤（Immune Cell Killing）：可实时动态观察和分析免疫细胞介导的对肿瘤细胞的杀伤作用；
10）免疫细胞聚集及增殖（Immune Cell Clustering and Proliferation）：可实时动态观察和定量分析免疫细胞的聚集和增殖。
IncuCyte 开发了很多满足特殊应用的套件，配有特别设计的定量分析软件。需要套件的应用包括：
1）监测细胞迁移（Cell Migration）/细胞侵袭（Cell Invasion）：配套高度一致性的96孔伤口划痕工具Wound Maker，实时动态监测伤口的愈合过程，可得到细胞进行划痕迁移运动的定量指标；
2）监测趋化运动（Chemotaxis）：配套专门的 96 孔板，定量分析贴壁细胞和悬浮细胞在趋化因子作用下的类似Transwell方法的细胞迁移（Migration）运动；
3）监测血管新生（Angiogenesis）：使用通过验证的血管新生试剂盒，具有动态分析血管新生的定量指标；
4）神经生长跟踪（Kinetic NeuroTrack）：可分别在相差和荧光成像基础上定量分析神经元细胞的神经突的生长状况。
以下我们重点讲述基本应用（细胞毒性、细胞凋亡、报告基因、干细胞生长、稀释克隆、三维肿瘤球体成像、免疫细胞杀伤、免疫细胞聚集和增殖）和需要套件的应用（细胞迁移、细胞侵袭、趋化运动、血管新生和神经跟踪）。细胞增殖、培养质控、细胞培养优化的原理见图 4 即可。
IncuCyte ZOOM：第二代长时间动态活细胞成像及数据分析系统的特点和应用（第二版）
总结：
以上一些关键的重要的应用介绍，展示了 IncuCyte ZOOM 系统在定量的、非入侵性的、实时细胞分析上的作用。非标记、非损伤性的成像技术以及数据分析可以让用户获得高质量的图像、录像和数据。与其他利用电子阻抗监测细胞不同，IncuCyte 可以记录细胞形态，得到图像和动态的录像。另外，Essen 还开发出更多的活细胞实时动态观察试剂盒（live cell kinetic assays and reagents），与 ZOOM 配套使用，进行实验开发（assay development）、技术评估（technology assessment）、外包服务（fee-for-service outsourcing）和药物开发合作（drug discovery partnerships）。
