纯化指南

　　分离技术是高科技产业中生物工程技术和中草药现代化中最重要的组成部份之一。生物分子的纯化，一般是指蛋白、酶、抗体及抗原、肽类、多肽类激素、核酸及多糖等的分离纯化。天然药物的纯化包括植物药物中一个或多个有效成分的分离纯化。根据待测样品的物理和化学特性，选择适当的分离方法和分离介质，方能筛选出经济、有效的纯化流程。



【粗品的纯化】

　　在常压或低压下处理大量的粗品时，为了避免堵塞柱子，一般使用MKF-CISLM, MKF-CICLM, MKF-AIQLM或MKF-AIWLM等30um、50um大颗粒离子交换介质。MKF类离子交换介质有不同的交换容量可供选择。

【高盐样品的纯化】

　　经硫酸氨沉淀过的样品处于高盐状态，适合用疏水层析。MKF疏水层析介质的疏水性强弱程度，依次为苯基>C8>C4>醚链。在高盐浓度下，蛋白质的疏水基团暴露程度增加，疏水性变强。其在树脂上的吸附强度与树脂疏水性和盐浓度直接相关。选择合适的疏水作用介质，无机盐的用量可以降低到最低，活性回收达到最大。强疏水性介质常用来分离弱疏水性的蛋白，弱疏水性介质则用来纯化疏水性很强的蛋白质比如单克隆抗体和膜蛋白，如果这两种蛋白和疏水介质结合的非常牢固会导致低的回收率。



【肽类的纯化】

　　肽类多来自天然萃取，合成肽和重组肽三种。肽在分离纯化中出现的变性，可在有机溶剂中复性，所以肽类的纯化多选择反相层析如MKF-RPLM, MKF-RPLH或离子交换预装柱。MKF反相层析填料有不同的粒径选择，20μm、50μm和80μm的大颗粒规格可用于肽分子的制备。
　　MKF系列反相柱有分析、半制备和制备不同的规格，其装填的反相介质亦有不同的孔径和粒径，介质粒度均匀，比表面积大，反压低，载样量大，批次之间的重现性好，可以实现从分析柱到制备柱的线形放大。

【蛋白的纯化】

　　来自天然萃取的蛋白用MKF-反相大孔填料可得到很好的分离。
　　重组蛋白在设计、构建时已考虑纯化方式。含组氨酸标记的融合蛋白可用MKF-螯合Ni2+金属的亲和层析介质，在一般或变性条件（8M 尿素）下通过组氨酸螯合融合蛋白达到纯化的目的。
　　MKF-Ni2+螯合的亲和层析介质也适合于抗体及抗体结合复合物的分离纯化，当使用固定化的Ni2+离子时，抗体的结合会大大改善。而且类亲合层析介质对蛋白的结合能力更好，稳定性强，尤其适于制备层析分离。
变性纯化后的蛋白需要复性至蛋白的天然构像。MKF-RP20μm反相层析介质适合纯化复性前的粗品，还可以用1M NaOH清洗再生。对变性的蛋白，可用各种MKF离子交换层析介质吸附固定。然后除去变性剂，蛋白在介质上成功复性，再将复性好的蛋白洗脱下来。用MKF疏水层析介质与变性蛋白表面的疏水氨基酸残基有相互作用的倾向，可抑制变性蛋白分子之间的相互聚集，同时还能在分子水平上给变性蛋白分子提供能量，使其脱水并折叠成天然构象或不同的折叠中间体。在适当的色谱条件下，可使几种变性蛋白一步实现复性并同时纯化。用这种方法能避免一般复性过程中蛋白质聚体的形成，所以复性得率高，而且无需稀释样品，并将复性和初纯化合二为一，大大节省了时间并提高了回收率。
　　膜蛋白纯化时常涉及去污剂的清除。去除离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷的MKF离子交换介质，非离子性去污剂可用疏水层析除去。
　　制备均一蛋白质样品时，可使用MKF阴离子交换介质去除DNA或病毒。DNA或病毒与阴离子交换介质的结合力较强，使用不同的盐浓度可将蛋白和DNA及各种病毒分离。因此，MKF阴离子交换介质能方便地用于DNA及病毒的去除或生产。

【核酸、寡核苷酸的纯化】

　　核酸大致有质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。可用分离大分子的MKF大孔凝胶介质去除杂蛋白，再配合如MKF-AIQL强碱型离子交换介质，可取得良好的分离效果。
　　寡核苷酸可用MKF-RP反相柱分离。而反义DHA、RNA测序、PCR和cDNA合成等研究中的寡核苷酸，由于合成后含三苯甲基，在pH12条件下用阴离子交换介质MKF-AIQL可去除副产物，并能避免凝集和保护基的脱落。载量大大高过反相层析，可用做大量制备。

【多糖、糖蛋白的纯化】

　　植物来源的多糖有水溶性、酸溶性、碱溶性多种，综合利用分子筛及离子交换层析有助获得各组份的纯品。另外，多糖药物需去除可引起过敏反应的蛋白质，采用阴阳离子交换法能快速去除多糖中残存的蛋白质。
MKF有机凝胶型大孔填料和各种阴离子、阳离子交换层析介质可供选择。

【中草药有效成分的纯化】

　　中草药的化学成分极其复杂，有效成分多较为亲水，包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。综合利用多种层析方法，如离子交换、分子筛、反相和疏水层析，更容易分离到单一活性成分。
生物碱在酸性缓冲液中带正电，用MKF阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常近似的生物碱。相反，黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中，用MKF阴离子交换柱分离效果良好。
　　MKF大孔树脂可用于黄酮苷类成分的分离、纯化；绞股蓝总皂苷的精制；贯叶金丝桃提取物的制备等。10um，20um，30um反相层析介质适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备，可用范围为pH1-14。MKF-有机凝胶型介质兼有吸附性层析和分子筛功能，可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂，广泛用于各种天然产物的分离。比传统硅胶反相填料更易于工艺优化。而且可用NaOH溶液在位清洗、再生，使用寿命更长，从长远上降低了分离纯化的成本。