两大方法帮你搞定质粒构建

质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA 连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体 DNA 进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

质粒构建方式多样，常规的 T4 连接酶，以及最近更受欢迎的重组酶方式。下面小编就总结一下 T4 连接酶与重组酶构建质粒方法，通过比较，其最大的不同点可能在于目的基因的设计以及连接体系。

一. T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 连接酶，可以催化粘端或平端双链 DNA 或 RNA 的 5’-P 末端和 3’-OH 末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需 ATP 作为辅助因子。

1. 质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。

酶切体系一般选择 50ul，试剂加好之后 37°C 孵育 6~8 小时，或适当延长时间，保证质粒酶切完全。每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。酶切后载体通过切胶回收线性化载体。

2. 根据目的序列构建引物后，引物设计原则简单总结一下:

（1）前向引物：5’ 端 - 保护碱基序列 + 限制性内切酶 1 酶切位点序列 + 基因正向引物序列 -3’ 端

（2）反向引物：5’ 端 - 保护碱基序列 + 限制性内切酶 2 酶切位点序列 + 基因反向引物序列 -3 ’端

如果目的基因片段较长的话，可以选择 PCR 方式扩增目的基因片段

引物扩增之后，首先要进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小，然后通过胶回收，获得纯化目的片段产物. 由于加入保护碱基，回收产物需要进行双酶切，双酶切方法与质粒酶切方法相同。

3. 载体与目的基因的连接，推荐在 10~20μl 反应体系中进行接反应。

4. 转化

将连接产物转化到受体菌中（一般为 DH5a），涂板，培养过夜。

5. 挑取单克隆，并鉴定

挑去平板上的单克隆培养，可以通过 PCR 或者酶切初步鉴定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。

下面开始重点介绍重组酶构建质粒，基于同源基因重组原理，适用于向几乎任何载体在任何位点进行定向克隆，无需考虑插入片段自身携带的酶切位点可高效克隆 50 bp～10 kb 片段，同时构建时间也大大缩短。

1. 载体的制备一般推荐双酶切线性化，线性化完全，假阳性克隆低。酶切体系同上。

2. 对于使用重组方式连接来说，PCR 要设计引物, 设计引物时要根据质粒载体和基因序列选择合适的同源序列，通过 PCR 扩增方式进行连接，PCR 的产物要纯化。

如果设计的基因特异插入片段扩增产物长度较长，可以选择 PCR 方式进行目的引物的扩增。

PCR 扩增后，通过胶回收方式获得纯化的 PCR 产物。纯化后的 PCR 产物不需要进行酶切，直接用于重组反应。

3. 目的引物与线性载体进行重组反应。

在冰水浴中配制，配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，置于 37 ℃ 反应 30 min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却 5 min。重组效率在反应 30 min 左右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率，这样大大减少了连接时间。

4. 转化

将连接产物转化到受体菌中（一般为 DH5a），涂板，培养过夜。

5. 挑取单克隆，并鉴定

挑去平板上的单克隆培养，可以通过 PCR 或者酶切初步鉴定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。

最后，几个主要注意事项：

1. 载体克隆位点选择尽量选择无重复序列，且 GC 含量比较均匀的区域进行克隆。当克隆位点上下游 20 bp 区域内 GC 含量均在 40%～60% 范围之内时， 克隆效率将达到最大.

2. 最适克隆载体与插入片段摩尔比为 1:2，即最适插入片段使用量为 0.06 pmol。这些摩尔数对应的 DNA 质量可由以下公式粗略计算获得：

最适克隆载体使用量 = [0.02 × 克隆载体碱基对数] ng（0.03 pmol）

最适插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段碱基对数] ng（0.06 pmol）

3. 双酶切 1 和 2，在设置酶切体系时要考虑酶切温度以及 Activity in NEBbuffer 的问题，可在 NEB 公司主页的 Double Digest Finder 里面进行查询。