献给初学者:细胞虐我千百遍 我待细胞如初恋
丁香园
细胞培养的过程大概是这样的:失败—成功—体味—收获—思考—交流,你到了哪个阶段?不妨和我们一起来看看丁香园上各位站友养细胞的那些事。
心肌细胞培养体会
记得刚养心肌细胞时候,开始时候很顺利,但有一次突然细胞就不怎么贴壁了,换液时候一吹打,就发现有许多细胞脱落。我检查了培养箱,可是别人的细胞都长的很好,培养基的问题?我仔细观察了一下,培养基粉红透亮,绝对不会污染,血清也没有问题,大家都是公用的血清。
当时我很迷惑,后来我向老师如实反映问题,他听完我的叙述后想了想,让我把培养基拿给他看,然后告诉我,你的培养基颜色太深了,肯定偏碱,细胞在偏碱的情况下培养,耐受能力会逐渐下降,可能是产生脱壁现象的原因。
后来我重新测了一下培养基,为 7.5 左右,我用灭菌的 HCL 调了一下,培养基颜色变成淡红透亮。再次培养,发现细胞贴壁比较好了,搏动效果也不错。因此,我以后每次培养前都要重新调好 pH 值,我觉得很多因素是能影响 pH 值的,这也算是实验的一点收获吧。(作者:丁香园站友 @windboy77)
低级错误浪费时间
在做实验时经常会有一些低级错误的发生,例如,我在做细胞免疫组化时就发生了这样的一个错误:我的细胞是养在 24 孔板里的,细胞固定时我就直接加入了丙酮固定,结果板子里面一片白白的,这时才赶紧询问他人,方知塑料制品会被丙酮所溶,真是好笨。
另有一次,我做细胞爬片时,因为觉得盖玻片不好处理,就自做主张地用了载玻片,那可是我自己花钱去做的小玻片。结果是虽然细胞长在了上面,但是用荧光显微镜观察细胞染色情况时却怎么也看不清楚,换用了盖玻片就好了。结果被实验室主任训了一顿:谁让你自做主张换玻片的?唉,不仅花了钱,浪费了时间,白费了心血,才得出这样的结论。(作者:丁香园站友 @冬日阳光)
昆虫细胞培养体会
鄙人也算养了快一年的昆虫细胞了,而且最近又在做昆虫血液的原代培养,积累了点点经验,说出来大家共勉。
首先,要广泛阅读细胞培养方面的专业书籍,打造自己扎实的专业基础,为以后的操作做准备。这方面的书有很多,《体外培养的原理与技术》,薛庆善主编,科学出版社;《细胞实验指南》,D.L. 斯佩克特,etc 著,黄培堂等译;《细胞培养》,司徒镇强等。
其次,每种细胞的培养条件都不相同,别人的经验和书本上的 protocal 都只能作为参考,真正重要的是自己培养过程中的不断摸索,这就需要对自己培养过程中细胞出现的状况作详细记录,随时总结。
再次,培养要有极大的耐心,过程中的影响因素又很多,这又是细活,其过程需要考虑各种影响因素,当出现问题时一一加以排除,找到最佳解决方案。我在这里没有讨论细胞培养的细节问题,因为那样的话是说不完的。(作者:丁香园站友 @savid888)
如何防止细胞污染
我就怎样防止污染说说我的体会。每个人都担心细胞被污染,每个人都有碰到自己的细胞被污染。起初我学习细胞培养的时候,都是向师哥师姐学习,基本上就是依葫芦画瓢。随着时间的推移,自己也就觉得有些步骤可以省略,有些就要注意。
我个人认为比较重要的几点如下:
东西一定要用自己的。既不要借别人的,也不要借给别人。可能大家觉得比较自私。实际上还是很有好处的。并不是每个人的操作都规范,因此相互之间串着用,很容易造成交叉污染。
我习惯口对口倒液体,在倒前倒后都要在酒精灯上过一下。自己认为比起用吸管吸更能很好的防止污染。步骤越简单,越能防止污染,而且还能节省很多吸管。
一次将所有的所需要试剂、工具放入工作台。不要做到半路,又出工作间拿东西,这样增加了污染的机会。
整个操作要快、动作要轻、而且不要干其他的事情。比如手机响了,最好不要接。我一般操作的时候将手机关了,手机声音响起,好烦躁。
我一般开紫外线照射台的时候,就将培养基、酶、DHANKS 液拿到室外让它自然升温。这样 40 分钟后,温度也升上来了。有很多人将他放到 37 度水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生,有的常年不清洗,里面很脏,容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此用它的也一定要勤换水。从水浴锅拿出后,最好找个毛巾插干上面的水。
操作前要洗手,用 75% 酒精搽手。
用完操作台,要打扫卫生。
细胞要经常冻存,我一般只要细胞状态好就将细胞冻存起来。细胞状态差了,扔掉,重新复苏。这是一个必须养成的习惯。毕竟很多情况下,细胞并不是因为污染了,才让你感到头痛。这样你不会担心没有种子了。
我一般是不加双抗的,只要注意,不会污染。(作者:丁香园站友 @tangdl2000)
纤维细胞培养经验
我曾经在自己制作的无细胞真皮上养过成纤维细胞,无细胞真皮是按照文献的方法制作的,把成纤维细胞接种到无细胞真皮上的方法也是按书和文献中的方法。可是很奇怪,成纤维细胞怎么都不长,我重复了好多次,结果都是失败。后来又做了对照,同样的条件,一个平皿中直接接种成纤维细胞,另一个平皿中放入无细胞真皮,再接种成纤维细胞,结果,没有无细胞真皮的平皿中细胞长得很好。
这样说明不是细胞和平皿的问题,那么问题在哪里呢?我苦思了很久,觉得是不是无细胞真皮在处理的过程中用到了一些化学药品,对细胞的生长有害,可是在接种细胞以前我已经按文献上的方法将无细胞真皮用 DMEM 培养液浸泡了 48 小时,在后来的实验中我就将浸泡的时间延长,并在中间每天换浸泡液一次,经过 5 天的浸泡以后,成纤维细胞的接种最终成功了。
这份迟到的成功提醒我,对于书和文献上的东西,不能不信,也不能全信,很多东西还得靠自己在实验中摸索。(作者:丁香园站友 @xiaoyuaizuguo)
悬浮细胞培养经验
1. 无菌操作是一切技术的基础,切记此条。
2. 在细胞状态好时,乘胜追击,准备好一切所需要的细胞原料。
实验同时需要采用 FCM 检测药物干预后细胞周期的改变,需要做 IHC,Werstern Blot,RT-PCR 等时,可以现将细胞处理好后,根据不同的实验步骤,保存细胞标本,然后各个击破,这样可以减少实验时间。
如要收集不同浓度点和时间点的标本,细胞处理后,部分用来做流式测周期(固定那步可以放置 -20 度数日,待标本收集全后一起检测)。部分用来细胞涂片(固定后,可以放 -20 度数月,本人曾放置 3 月没影响)。部分用来做 Werstern Blot(将细胞离心呈粉末状置 -80 度保存,或者提取蛋白变性后保存,粉末保存时间可达 2 月)。部分用于提取 RNA 时,可现加上 Trizol 混匀后,置 -80 度保存。
原料准备好后,在根据自己的时间进行合理安排,多出时间查阅文献。
3. 在进行每个实验时,一定要找到该实验的详细的 Protocal,一步一步踏踏实实的完成,一般都会得到比较理想的结果。(作者:丁香园站友 @liuhl)
怎么样?这些经验技巧你 get 了吗?