献给初学者:细胞虐我千百遍 我待细胞如初恋
丁香园
细胞培养的过程大概是这样的:失败—成功—体味—收获—思考—交流,你到了哪个阶段?不妨和我们一起来看看丁香园上各位站友养细胞的那些事。
1. 心肌细胞培养体会
作者: windboy77
记得刚养心肌细胞时候,开始时候很顺利,但有一次突然细胞就不怎么贴壁了, 换液时候一吹打,就发现有许多细胞脱落。我检查了培养箱,可是别人的细胞都长的很好,培养基的问题?我仔细观察了一下,培养基粉红透亮,绝对不会污染,血清也没有问题,大家都是公用的血清。
当时我很迷惑,后来我向老师如实反映问题,他听完我的叙述后想了想, 让我把培养基拿给他看,然后告诉我, 你的培养基颜色太深了,肯定偏碱,细胞在偏碱的情况下培养,耐受能力会逐渐下降,可能是产生脱壁现象的原因。
后来我重新测了一下培养基,为 7.5 左右, 我用灭菌的 HCL 调了一下, 培养基颜色变成淡红透亮。 再次培养, 发现细胞贴壁比较好了, 搏动效果也不错。 因此, 我以后每次培养前都要重新调好 PH 值, 我觉得很多因素是能影响 PH 值的, 这也算是实验的一点收获吧。
2. 低级错误浪费时间
作者: 冬日阳光
在做实验时经常会有一些低级错误的发生, 例如, 我在做细胞免疫组化时就发生了这样的一个错误: 我的细胞是养在 24 孔板里的, 细胞固定时我就直接加入了丙酮固定, 结果板子里面一片白白的, 这时才赶紧询问他人, 方知塑料制品会被丙酮所溶, 真是好笨。
另有一次, 我做细胞爬片时, 因为觉得盖玻片不好处理, 就自做主张地用了载玻片, 那可是我自己花钱去做的小玻片。
结果是虽然细胞长在了上面, 但是用荧光显微镜观察细胞染色情况时却怎么也看不清楚, 换用了盖玻片就好了。 结果被实验室主任训了一顿: 谁让你自做主张换玻片的? 唉, 不仅花了钱, 浪费了时间, 白费了心血, 才得出这样的结论。
3. 昆虫细胞培养体会
作者: savid888
鄙人也算养了快一年的昆虫细胞了, 而且最近又在做昆虫血液的原代培养, 积累了点点经验, 说出来大家共勉。
首先, 要广泛阅读细胞培养方面的专业书籍, 打造自己扎实的专业基础, 为以后的操作做准备。 这方面的书有很多,「体外培养的原理与技术」, 薛庆善主编, 科学出版社;「细胞实验指南」,D.L. 斯佩克特,ets 著, 黄培堂等译;「细胞培养」, 司徒镇强等。
其次, 每种细胞的培养条件都不相同, 别人的经验和书本上的 protocal 都只能作为参考, 真正重要的是自己培养过程中的不断摸索, 这就需要对自己培养过程中细胞出现的状况作详细记录, 随时总结。
再次, 培养要有极大的耐心, 过程中的影响因素又很多, 这又是细活, 其过程需要考虑各种影响因素, 当出现问题时一一加以排除, 找到最佳解决方案。 我在这里没有讨论细胞培养的细节问题, 因为那样的话是说不完的。
4. 如何防止细胞污染
作者: tangdl2000
我就怎样防止污染说说我的体会。 每个人都担心细胞被污染, 每个人都有碰到自己的细胞被污染。 起初我学习细胞培养的时候, 都是向师哥师姐学习, 基本上就是依葫芦画瓢。 随着时间的推移, 自己也就觉得有些步骤可以省略, 有些就要注意。
我个人认为比较重要的几点如下:
东西一定要用自己的。 既不要借别人的, 也不要借给别人。 可能大家觉得比较自私。 实际上还是很有好处的。 并不是每个人的操作都规范, 因此相互之间串着用, 很容易造成交叉污染。
我习惯口对口倒液体, 在倒前倒后都要在酒精灯上过一下。 自己认为比起用吸管吸更能很好的防止污染。 步骤越简单, 越能防止污染, 而且还能节省很多吸管。
一次将所有的所需要试剂、工具放入工作台。 不要做到半路, 又出工作间拿东西, 这样增加了污染的机会。
整个操作要快、动作要轻、而且不要干其他的事情。 比如手机响了, 最好不要接。 我一般操作的时候将手机关了, 手机声音响起, 好烦躁。
我一般开紫外线照射台的时候, 就将培养基、酶、DTHANKS 液拿到室外让它自然升温。 这样 40 分钟后, 温度也升上来了。 有很多人将他放到 37 度水浴锅里加热。 一定要注意水浴锅的卫生, 有的常年不清洗, 里面很脏, 容易在外面瓶身上吸附大量细菌。 因此用它的也一定要勤换水。 从水浴锅拿出后, 最好找个毛巾插干上面的水。
操作前要洗手, 用 75%酒精搽手。
用完操作台, 要打扫卫生。
细胞要经常冻存, 我一般只要细胞状态好就将细胞冻存起来。 细胞状态差了, 扔掉, 重新复苏。 这是一个必须养成的习惯。 毕竟很多情况下, 细胞并不是因为污染了, 才让你感到头痛。 这样你不会担心没有种子了。
我一般是不加双抗的, 只要注意, 不会污染。
5. 纤维细胞培养经验
作者: xiaoyuaizuguo
我曾经在自己制作的无细胞真皮上养过成纤维细胞, 无细胞真皮是按照文献的方法制作的, 把成纤维细胞接种到无细胞真皮上的方法也是按书和文献中的方法。 可是很奇怪, 成纤维细胞怎么都不长, 我重复了好多次, 结果都是失败。
后来又做了对照, 同样的条件, 一个平皿中直接接种成纤维细胞, 另一个平皿中放入无细胞真皮, 再接种成纤维细胞, 结果, 没有无细胞真皮的平皿中细胞长得很好。
这样说明不是细胞和平皿的问题, 那么问题在哪里呢? 我苦思了很久, 觉得是不是无细胞真皮在处理的过程中用到了一些化学药品, 对细胞的生长有害。
可是在接种细胞以前我已经按文献上的方法将无细胞真皮用 DMEM 培养液浸泡了 48 小时, 在后来的实验中我就将浸泡的时间延长, 并在中间每天换浸泡液一次, 经过 5 天的浸泡以后, 成纤维细胞的接种最终成功了。
这份迟到的成功提醒我, 对于书和文献上的东西, 不能不信, 也不能全信, 很多东西还得靠自己在实验中摸索。
6. 悬浮细胞培养经验
作者: Liuhl
(1) 无菌操作是一切技术的基础, 切记此条。
(2)在细胞状态好时, 乘胜追击, 准备好一切所需要的细胞原料。
实验同时需要采用 FCM 检测药物干预后细胞周期的改变, 需要做 THC,Werstern Blot,RT-PCR 等时, 可以现将细胞处理好后, 根据不同的实验步骤, 保存细胞标本, 然后各个击破, 这样可以减少实验时间。
如要收集不同浓度点和时间点的标本, 细胞处理后, 部分用来做流式测周期 (固定那步可以放置 -20 度数日, 待标本收集全后一起检测)。 部分用来细胞涂片 (固定后, 可以放 -20 度数月, 本人曾放置 3 月没影响)。
部分用来做 Werstern Blot(将细胞离心呈粉末状置 -80 度保存, 或者提取蛋白变性后保存, 粉末保存时间可达 2 月)。 部分用于提取 RNA 时, 可现加上 Trizol 混匀后, 置 -80 度保存。
原料准备好后, 在根据自己的时间进行合理安排, 多出时间查阅文献。
(3)在进行每个实验时, 一定要找到该实验的详细的 Protocal, 一步一步踏踏实实的完成, 一般都会得到比较理想的结果。
怎么样? 这些经验技巧你 get了吗?
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