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这些内参设置的潜规则,你都知道吗?

丁香实验

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WB 已然成为蛋白实验中的「大众情人」技术,然其步骤繁琐,处处是坑,错一步而全盘皆输。不同 level 的科研狗在享受它魔力的同时,也被折磨的心力交瘁。为彻底驯服 WB,获得教科书级的亮瞎眼条带,内参君的选择是首先需要考虑的。

内参君何许人也?

所谓内参君,一般是指由管家基因编码表达的蛋白,因其恒定表达,故而可作为完美的参照物,来矫正蛋白定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果准确性。

不是人人可做内参君(内参君的选择标准)

√ 分子量大小:内参蛋白与目的蛋白分子量需要有一定差异。例如, 如果需要检测自噬 marker LC3B(~14-17 kDa),则应避免使用 Cofilin 或 Cyclophilin B(~20 kDa)这些分子量与目标蛋白接近的内参蛋白。

√ 表达水平:选择的内参蛋白需要在待测样本中是高表达的。常用的内参蛋白是由管家基因高表达的,是细胞发育和维持细胞活力所必须的。例如,细胞核的内参蛋白 PCNA,在 DNA S 期表达,因此对于非增殖细胞不推荐使用。

√ 表达因素:选择表达不受实验变量影响的内参,例如,细胞应激反应中 HSP60 会表达上调,因此在研究细胞应激实验中,应该避免使用 HSP60 作为内参蛋白。

高曝光率内参君大阅兵

养兵千日,看内参君三步法亮剑

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