看了这些引物合成技巧，老板再也不用担心我 P 不出来了
生物学霸
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本文章主要提供给新手，希望对各位有帮助。
1、引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA 合成仪有很多种，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成 DNA 片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将 DNA 固定在固相载体上完成 DNA 链的合成的，合成的方向是由待合成引物的 3' 端向 5' 端合成的，相邻的核苷酸通过
3'→5' 磷酸二酯键连接。
第一步，将预先连接在固相载体 CPG 上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其 5'-羟基的保护基团 DMT，获得游离的 5'-羟基。
第二步，合成 DNA 的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的 3'端被活化，5'-羟基仍然被 DMT 保护，与溶液中游离的 5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽（capping）反应，缩合反应中可能有极少数 5'-羟基没有参加反应（少于 2%），用乙酸酐和 1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的 5'-羟基上的保护基团 DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察 TCA 处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在 CPG 上的引物被切下来，通过 OPC，PAGE 等手段纯化引物，成品引物用 C18 浓缩、脱盐、沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定 OD 260 定量，根据定单要求分装。
2、引物纯化方式有哪些，如何选择？
C18 柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对 DNA 有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通 PCR 反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。
OPC 纯化： OPC 纯化是根据 DNA 保护基（DMTr 基）和 Cartridge 柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的 DNA 片段。OPC 法纯化的 DNA 纯度大于 95%。适用于 40 mer 以下引物的纯化。
PAGE 纯：PAGE 纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对 DNA 片段进行分离，然后从凝胶中回收目的 DNA 的方法。PAGE 纯化法也是一种非常有效的 DNA 纯化方法，纯化后的 DNA 纯度大于 95%，对长链 Oligo DNA (大于 50mer）的纯化特别有效。
HPLC 纯化：HPLC 纯化是使用高效液相色谱的原理，对 DNA 片段进行纯化。纯度可以大于 99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。
3、引物的 OD 数如何定量？
引物合成引物 OD 数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长 260 nm，石英比色杯，光程为 1 cm，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到 0.2-1.0 之间。DNA 干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用 1 mL 水稀释测 OD 值。需要根据稀释倍数换算出母液的 OD 值。
4、需要什么级别的引物？
引物常用的纯化方式 C18 脱盐，OPC 纯化，PAGE 纯化，HPLC 纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用引物长度要求纯度级别要求：
45 base PAGE < 一般 PCR 扩增 < 45 base OPC
诊断 PCR 扩增 < 40 base OPC、 PAGE
DNA 测序 20 base 左右 OPC
亚克隆、点突变等， 根据实验要求定 OPC、 PAGE、HPLC
基因构建（全基因合成）根据实验要求定 PAGE
反义核酸 根据实验要求定 PAGE
修饰引物 根据实验要求定 PAGE、 HPLC
5、最长可以合成多长的引物？
引物越长，出现问题的概率就越大。我们合成过 120 base 的引物，但是产率很低。
除非需要，建议合成片段长度不要超过 80 mer，按照目前的引物合成效率，
80 mer 的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过 40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。
6、需要合成多少 OD 数？
根据实验目的确定。一般 PCR 扩增，2 OD 引物，可以做 200-500 次 50 μL 标准 PCR 反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD 就足够了。但是有些研究人员，就做几次 PCR，但是却要 5-10 OD。
做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高 OD 数。片段越长, 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的 OD 数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
7、如何检测引物的纯度？
实验室方便的作法是用 PAGE 方法。使用加有 7 M 尿素的 16% 的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取 0.2-0.5 OD 的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95℃、2 mins）。
加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600 V 电压进行电泳，一定时间后（约 2-3 小时）剥胶，用荧光 TLC 板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用 EB 染色或银染方式染色。
8、如何计算引物的浓度？
引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成 10-50 pmol/μL。 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物 OD 数是否一致。如果不一致，请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。
一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成 50 pmol/μL，加水的体积（微升）按下列方式计算：V（微升）= OD 数 x 3 3 x 20000 / 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。
注意：1 OD 260 = 33 μL/mL 。
9、如何计算引物的 Tm 值？
引物设计软件都可以给出 Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为 25 mer 以下的引物，Tm 计算公式为：Tm = 4℃（G + C）+ 2℃（A + T）
对于更长的寡聚核苷酸，Tm 计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log 10 [Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Size = 引物长度。
10、如何确定引物（含修饰） 的分子量？
非修饰的引物的 Molecular Weight 在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为 324.5，引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量。
或按下列公式计算 MW=（NA x WA）+（NC x WC）+（NG x WG）+（NT x WT）+（Nmod x Wmod） ＋（Nx x Wx）+( Nix Wi）+16 x Ns– 62
NA、 NG、NC、 NT、 Ni 分别为引物中碱基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的数量，WA、 WC、 WG、 W、 Wi、分别为引物中碱基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的分子量。Nmod、Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。
对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如 G+A 混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns 为硫代数目，硫代每个位置增加分子量 16。
常规碱基分子量（Base Molecular Weight）
A 313.21
C 289.18
G 329.21
T 304.19
I 314.2
U 290.17
常规修饰基团分子量
5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60
5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49
5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46
5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07
5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18
5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12
未完待续。
文章作者：丁香园论坛版主@liuzeyi2002
