如何为甲基化特异 PCR 设计引物

作为一个刚入门的科研新手时， 做 PCR 都是师兄师姐把所需引物、试剂拿来，再甩出一个 Protocol，照着程序性加样、上机就行了，感觉也没什么技术含量。轮到做自己的课题时，还真是犯了点愁，四处请教，逛论坛看各种帖子，寻找一些设计原则，最后也算形成了自己的一套流程，可以给一些还在迷茫的初学者们一些参考。

下面以 （SOD1） 为例，一步步演示。

一般的 PCR 所需序列可以在 NCBI Gene 上，但是甲基化发挥作用主要在启动子区域，基因序列要包含第一外显子的上游碱基，所以查找基因序列可以用 UCSU 的 Genome Browser （http://genome.ucsc.edu/）。

1. 点击 Genomes 选择对应的染色体标本

   

2. 输入基因名称

   

3. 选择基因转录本

   注意一个基因可能有多个转录本，在 RefSeq Genes 里选择你要查找的序号。

   

4. 查看基因序列

   

5. 设置参数

   

6. 点击 submit 便出现了外显子大写的的基因序列，可 copy 到 word 里保存供以后参考。

利用甲基化设计的网站 Meth Primer （http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi1）粘贴基因序列。

1. 粘贴基因序列

   包含第一外显子和上游碱基的基因序列。

2. 设置条件

   

3. 查看结果

   网站给出的几个参考的引物相差不大，可以根据自己的需要重新设置条件来重新设计。另外可以根据一些设计引物的原则来筛选合适的引物。我也整理了一些关于引物设计的原则，供参考。

   

网站给出的几个参考的引物相差不大，可以根据自己的需要重新设置条件来重新设计。另外可以根据一些设计引物的原则来筛选合适的引物。我也整理了一些关于引物设计的原则，供参考。

1. 确保目标序列中有非 CpG 的 C 的个数。

   如果你没有足够的 C 位于非 CpG 内，那么未转化的 DNA 和甲基化的 DNA 看上去会差不多，以 6～7 个 CpG 为理想。如果低于这个，那么特异性会降低。你会得到非特异性的扩增，因为它区分度不够。

2. 让产物短一点

   亚硫酸氢盐转化的过程会损伤模板 DNA，因此尝试扩增较小的片段（小于 150 bp），将得到最佳的结果。如果你通过电泳来运行产物，那么确保你能够将 M 引物的产物与 U 引物的分开。

3. 遵守 PCR 的原则 PCR 引物设计的所有原则也适用于 MSP。

   1）引物的退火温度要相当，如果可以的话，将 M 引物和 U 引物设计成相同的条件，这样可同时运行。

   2）引物之间不要形成二聚体，一般引物自身连续互补碱基不大于 3 bp。