质粒提取注意事项

生物学霸2016-07-01

14172

经常提质粒吗？熟练之后，提质粒乃至质粒构建都很简单。但如果真问起一些质粒的细节，可能很多人回答不了。不信随我看看。

质粒组成要素

一个合格的质粒含有以下组成部分：

1. 复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
2. 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ 、Kan+。
3. 多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段
4. P/E 启动子/增强子
5. Terms 终止信号
6. 加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用

如何阅读质粒图谱

第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）。

第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。

1. Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
2. tetr 可以阻止四环素进入细胞。
3. camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
4. neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使 G418（长那霉素衍生物）失活
5. hygr 使潮霉素β失活。

第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。

第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。

启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号

1. 启动子－促进 DNA 转录的 DNA 顺序，这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
2. 增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。
3. 核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是 AUG（起始密码）和 SD 序列。
4. 转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down－stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这 2 部分共同构成 poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down－stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这 2 部分共同构成 poly（A）加尾信号。

为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条 DNA 链，即质粒是环状双链 DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上。

如何选择载体

把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。

P.S. 基因工程所用的 vector 实际上是 DNA 分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的 DNA。

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述 3 点：

1. 构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

2. 载体的类型：

克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。

表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

对原核表达载体应该注意 3 点：选择合适的启动子及相应的受体菌；用于表达真核蛋白质时注意克服 4 个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

3. 载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。

选用质粒（最常用）做载体的 4 点要求：

1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5 kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；
2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10 个以上的拷贝，而严谨型质粒 < 10 个。
3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；
4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。

无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。

作者：amelia_yuan，经其授权转载

配图来源：网络