一箭双雕的「潜力股」，曹丰团队 Circ Res 报道它既可广谱抗癌，又能缓解阿霉素心脏毒性
阿霉素是目前可用的最有效的抗肿瘤药物之一。然而，由于其具有严重心脏毒性的风险，其临床用途受到限制。
之前的工作已确定，CircITCH （环状 RNA ITCH）是一种广谱的肿瘤抑制性环状 RNA，其编码基因 ITCH（E3 泛素蛋白连接酶）与阿霉素引起的心脏毒性有关。然而，CircITCH 是否在阿霉素引起的心脏毒性中发挥作用尚不清楚。
2020 年 5 月 11 日，来自中国人民解放军总医院（301 医院）的曹丰团队在 Circulation Research 上发表了题为 The Tumor-Suppressive Human Circular RNA CircITCH Sponges miR-330-5p to Ameliorate Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity Through Upregulating SIRT6, Survivin, and SERCA2a 的研究性论文，揭示 CircITCH 通过上调 SIRT6，Survivin，SERCA2a，使 miR-330-5p 海绵化，改善阿霉素诱导的心脏毒性。
图片来源：Circulation Research
研究内容
阿霉素引起心脏毒性和正常人心脏上的 circRNA 表达模式
为筛选可能参与阿霉素引起的心脏毒性的病理过程中的 circRNA，研究者收集了 3 例阿霉素引起的心肌病患者的尸检标本，和 3 名未患病健康捐献者的心脏，进行 circRNA 测序，并分析了表达。共检测到 19112 个 circRNA，其中 84.93％来自基因组外显子。
过滤差异表达的 circRNA 后，在阿霉素引起的心肌组织和正常组织共 356 个 circRNA 表达不同，其中 207 个显著上调，149 个下调。进一步通过 qPCR，检测在 CircBase 中索引的前十个上调 / 下调的 circRNA。在下调的 circRNA 中，研究者关注了 ITCH 来源的 circRNAs，有 5 个 ITCH 来源的 circRNAs 同工型在人原代心肌细胞，人左心室组织和人类诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）上表达。其中 hsa_ circ_0001141 是唯一一个能在这三种类型的细胞或组织上表达的，研究者将其命名为 CircITCH 。
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随后，研究者使用不同的引物，通过 qPCR 在健康人心脏和 hiPSC-CMs 上扩增出了预期大小的单个不同产物，并通过 Sanger 测序证明了从头至尾的剪切体的存在。
同时，通过 cDNA 和基因组 DNA（gDNA）作为模板，排除了这个剪切体是转录剪切或基因重排导致的。接下来，检测了 CircITCH 在阿霉素诱导时的表达变化，RNA 荧光原位杂交证明其表达是降低的。在阿霉素引起的心肌病中，CirciTCH 水平低于健康心脏和其他类型的衰竭心脏中的水平。这些数据提示 CirciTCH 在阿霉素引起的心脏病中可能发挥作用。
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CircITCH 过表达可缓解阿霉素引起的细胞死亡，收缩功能障碍和钙调控障碍
接下来，研究者探索了 CircITCH 在阿霉素诱导的 hiPSC-CM 损伤和功能障碍中的作用。使用腺病毒过表达 CircITCH，然后给予阿霉素。明场细胞形态学，CCK8，以及细胞活力测定，显示 CircITCH 过表达可防止阿霉素诱导的细胞活力丧失，乳酸脱氢酶漏出，心肌细胞坏死指数和 EthD1 阳性死细胞的数量均被抑制。使用高速视频显微镜检测了 CircITCH 过表达对细胞收缩特性的影响。阿霉素处理的细胞中，收缩 / 松弛速度和变形距离显著降低。
CircITCH 过表达可显著改善收缩特性（收缩速度和变形距离）和松弛特性（松弛速度和变形距离）。钙成像测量显示，阿霉素降低了细胞中的钙振幅并引起舒张期钙超载，CircITCH 的过表达减轻了这些变化。这些结果表明，CircITCH 的过表达可以防止阿霉素引起的细胞损伤和功能障碍。
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CircITCH 缓解阿霉素引起的细胞 / 线粒体氧化应激和 DNA 损伤
为了探索与 CircITCH 引起的心脏保护相关的机制，研究者接下来评估了 hiPSC-CMs 的氧化应激和 DNA 损伤水平（阿霉素引起的心脏毒性的两个主要原因）。与以前的报道一致，阿霉素治疗可诱导明显的 DNA 双链断裂（通过 γ-H2AX foci, 8-OHdG 表征）。此外，CircITCH 的过表达减少了线粒体 DNA 损伤（通过 mtDNA lesions 表征），还检测了线粒体和细胞 ROS 的产生。结果表明，阿霉素处理增加线粒体和细胞氧化应激，而 CircITCH 过表达可部分消除这种增加。
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CircITCH 通过海绵化 miR-330-5p 防止阿霉素引起的心脏毒性
据报道，CircITCH 在膀胱癌细胞中起 miRNA 海绵（形象说法，像海绵一样吸满了 miRNA，这样它就无法与天然靶点结合，长期抑制 miRNA 基因）的作用。
为了探讨 CircITCH 是否可以在 hiPSC-CM 中使 miRNA 海绵化，研究者选择了 8 个候选 miRNA。进行 CircITCH 探针下拉分析后，提取了 miRNA，并通过 qPCR 检测了候选 miRNA 的水平。下拉沉淀物中，显着富集了包括 miR-330-5p 在内的几种 miRNA。
为了进一步验证 miR-330-5p 和 CircITCH 之间的直接结合，采用了生物素化的 miR-330-5p 探针下拉 CircITCH。生物素偶联的 miR-330-5p 比突变体探针捕获更多的 CircITCH，证明 miR-330-5p 可以与 CircITCH 结合。此外，荧光原位杂交显示 hiPSC-CM 中，CircITCH 和 miR-330-5p 共定位。这些结果进一步验证了，CircITCH 和 miR-330-5p 在 hiPSC-CM 中的直接相互作用。
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此外，为了更精确 CircITCH 和 miR-330-5p 的结合位点，突变了预测位点，构建 CircITCH 表达载体。当 CircITCH 在位点 1、2 和 3 发生突变时，生物素 - CircITCH 探针下拉沉淀中的 miR-330-5p 水平显着降低，而其他 5 个位点突变没有显示出这样的减少。这些结果表明，结合位点 1、2 和 3 是 CircITCH 在 hiPSC-CM 中捕获 miR-330-5p 的必要条件。
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抑制 MiR-330-5p 可抑制阿霉素的心脏毒性
为了表征 miR-330-5p 在阿霉素引起的心脏毒性中的作用，研究者首先检测了阿霉素处理的 hiPSC-CM 中 miR-330-5p 的水平，其表达显著上调。因此，进行了 miRNA 抑制实验。结果表明，miR-330-5p 抑制作用可改善细胞活力，减少细胞死亡，抑制 LDH 和 cTnI 漏出，改善收缩和松弛速度，提高钙振幅，降低舒张压钙超载，钝化细胞和线粒体 DNA 损伤，抑制细胞和线粒体氧化应激。
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SIRT6，BIRC5 和 ATP2A2 是 miR-330-5p 的直接靶点
为了进一步找到 CircITCH 和 miR-330-5p 介导的下游分子，通过比较 miRWal 预测的靶点，锁定了 84 个候选靶点。由于竞争性内源 RNA 机制的一般规律（靶 mRNA 的表达通常与 circRNA 的表达呈正相关，但与 miRNA 的表达呈负相关；在疾病状态下，circRNA 和靶 mRNA 的变化是一致的），据此重合了 CircITCH 上调的靶基因和 miR-330-5p 下调的靶基因。通过这种方式，确定了 3 个可能的靶点，分别是 SIRT6，BIRC5 和 ATP2A（SERCA2a）。
随后，实验验证这三个可能的靶点。首先，进行了计算靶点扫描分析，确定了每个基因在其 3' UTR 中具有 2 个 miR-330-5p 的预测结合位点。其次，克隆了具有 SIRT6，BIRC5 和 ATP2A2 全长野生型 3'-UTR 区的荧光素酶报告基因质粒。MiR-330-5p 有效降低了 3 个报告基因的荧光素酶活性，表明 SIRT6，BIRC5 和 ATP2A2 3'-UTR 是 miR-330-5p 的直接靶点。
为了进一步确认作用位点，对 3'-UTR 区进行了突变。并通过荧光素酶报告基因进行检测，发现 SIRT6，BIRC5 的结合位点 1，ATP2A2 mRNA 3'-UTR 与 miR-330-5p 结合。
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CircITCH 在小鼠上改善阿霉素引起的心脏毒性
为了确定 CircITCH 是否在体内对阿霉素诱导的心脏毒性起作用，研究者采用了 AAV9（腺相关病毒血清型 9）的载体系统，来进行 CircITCH 在体内的过表达。在急性小鼠模型中，CircITCH 的过表达减少了阿霉素引起的心室组织空泡化。此外，有关心肌损伤的心脏酶研究表明，CircITCH 过表达有效降低了阿霉素引起的血清天冬氨酸 AST（转氨酶），LDH 和 CK-MB 的水平。
此外，超声心动图和侵入性血流动力学结果，表明 CircITCH 过表达改善阿霉素诱导的心功能降低。CircITCH 过表达改善了阿霉素诱导的左心室心肌纤维化。CircITCH 组中阿霉素诱导的心脏萎缩也被逆转，心肌细胞明显更大。同样地，在慢性小鼠模型中得到了同样的结果。
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创新点及展望
在目前的研究中，发现 CircITCH 可有效缓解体内和体外阿霉素引起的心脏毒性。机制上，CircITCH 作为内源性 miR-330-5p 海绵，可调节 SIRT6，Survivin 和 SERCA2a，CircITCH/miR-330-5p 轴通过 miR-330-5p 和 SIRT6，BIRC5 和 ATP2A2 的 3'-UTR 相互作用，调节氧化应激和 DNA 损伤，细胞死亡，收缩功能障碍和钙调节障碍。
本研究揭示了 CircITCH 在阿霉素引起的心脏毒性进展中的新作用，并确认它是针对阿霉素化疗的潜在治疗剂。因为 CircITCH 表现得更像是一支具有「一箭双雕」功能的「潜力股」，既增强了抑制肿瘤的能力，又同时降低了化疗心脏毒性。
