Cell 精读：UCSD 张瑾团队首次报道液-液相分离控制cAMP空间区隔和癌症信号通路

细胞内各种不同的生化反应途径都是由一系列不同的蛋白组成的，执行着不同的生理生化功能。各个信号通路通过中上游蛋白对下游蛋白活性的调节（包括激活或抑制作用），从而改变下游蛋白的立体构象完成信号传输。

环磷酸腺苷 (cyclic adenosine monophosphate, cAMP) 是细胞内重要的第二信使，在信号转导级联中发挥着核心作用，调节细胞内许多关键的生理和病理生理过程。

在真核生物中，cAMP 的产生通常是通过 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 介导的跨膜腺苷酸环化酶 (ACS) 的激活来响应激素信号而触发的，后者催化 ATP 合成 cAMP。cAMP 可激活蛋白激酶 A (protein kinase A, PKA)，然后磷酸化各种靶蛋白，从而在基因调控、细胞迁移、细胞增殖、细胞凋亡和线粒体稳态等方面发挥重要作用。因此，当 cAMP 的水平发生波动时，可影响细胞内环境，从而调控细胞功能。

cAMP 信号被效应蛋白所传导，cAMP 依赖性蛋白激酶 (PKA) 是一种四聚体全酶，由一个调节亚基二聚体与一对催化亚基结合。cAMP 与 PKA 调节亚基结合，释放 PKA 催化亚基 (PKA cat) 的活性，然后磷酸化细胞内无数的靶点。cAMP 和 PKA 相互协作严格控制许多生理过程，从细胞生长和存活乃至机体心脏和神经的多种功能。

图片来源：Cell

2020 年 8 月 25 日，美国加州大学圣地亚哥分校张瑾教授课题组在 Cell 在线发表题为 Phase Separation of a PKA Regulatory Subunit Controls cAMP Compartmentation and Oncogenic Signaling 的文章， 该研究首次发现 cAMP 依赖性蛋白激酶（PKA）的 I 型调控亚基 RIα 在 cAMP 信号作用下进行动态液 - 液相分离能够形成富含 cAMP 和 PKA 活性的生物分子凝聚物，为第二信使 cAMP 的空间区隔化和下游信号传输提供精准的控制。

由 PKA 的 RIα 亚基形成的 cAMP 生物分子凝聚体 (biomolecular condensates) 控制着局部信号转导，在这种情况下相分离的中断能够使 cAMP/PKA 信号通路紊乱，促进细胞增殖，诱导细胞转化，从而促进肿瘤的发生。

所谓的空间区隔化，这是三十多年前就提出的一种用来解释不同的 G 蛋白偶联受体是如何在聚集在无处不在的信使环磷酸腺苷 (cAMP) 的情况下实现特异性的理论。

研究结果

细胞内源水平上实现 PKA 调节亚基 RIα 的液 - 液相分离

在多个 PKA 调节亚基中，只有 RIα 是普遍存在且高表达的，它对 PKA 活性的调控是必不可少的。为了观察 RIα 亚基在细胞水平上的表达动态，该研究通过 CRISPR-Cas9 在 HEK293A 细胞的 RIα C 端引入 GFP 并得到 293-RIα 细胞系。

在新构建的细胞系中观察到类似于过表达 RIα 的高度动态化荧光斑点；并且令人惊讶的是，经过纯化和富集后的 RIα 变成了液滴状。研究显示随着聚乙二醇 (PEG) 浓度的增加，分子拥挤度的增加，也降低了液滴形成所需的 RIα 小分子的浓度；同时增加盐 (KCl) 浓度则增加了液体液滴形成所需的 RIα 的浓度。在体外和细胞中，发现 RIα 液滴的大小各不相同，内源性 RIα 小斑点只占整个细胞体积的 0.09% 左右。总之，这部分数据表明 RIα 可形成生物分子凝聚体，并且在内源表达水平能够产生同样的效果。

图片来源：Cell

PKAcat (PKA 催化亚基) 抑制 RIα 相分离，cAMP 增强 RIα 相分离

RIα 通过其 N - 末端二聚化和对接 (D/D) 结构域形成专性二聚体，桥接其与 AKAPs (A-kinase anchoring proteins) 的结合，连接 D/D 结构域和 cAMP 结合结构域是一个相对无序的连接区域，它包含一个抑制序列，可作为 PKAcat 的假底物。

为了探测这些域在 RIα 的液 - 液相分离中的作用，该研究了设计了一组带有 EGFP 标签的 RIα 突变体，并监测了它们在野生型 HEK293T 细胞中过表达时形成动态化荧光斑点的能力。研究发现缺少 D/D 结构域或接头区域的突变体未观察到荧光斑点，而在表达仅包含这两个区域的突变体的细胞中观察到荧光斑，说明包含 D/D 域和接头区域的片段是必要的，在一定程度上对于 RIα 的液 - 液相分离也是足够的。

图片来源：Cell

当与 cAMP 结合的 RIα 蛋白从 PKAcat 解离时，抑制序列和部分连接区域变得混乱。由于这一区域参与了 RIα 的液 - 液相分离，表明 PKAcat 和 cAMP 可能直接影响这一过程。另一方面，cAMP 在 PKAcat 存在的情况下直接增强 RIα 蛋白群的液 - 液相分离，因为 cAMP 的加入在体外减弱了 PKAcat 对 RIα 蛋白群小液滴形成的抑制作用，并允许低 RIα 蛋白群浓度下的小液滴形成在表达 GFP1-10 的 293-RI 型细胞中，用 AC 激活剂 Forskolin (Fsk) 刺激 cAMP 升高可导致内源性 RIα 型斑点状细胞的急性增加。

此外，通过肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素增加 cAMP 水平可瞬时增加每个细胞内源性 RIα 荧光斑点的数量，这与 GPCR 激动剂诱导的 cAMP 的效果一致。这些数据表明，当 cAMP 结合的 RI 与 PKAcat 分离时，其抑制序列和连接区域的紊乱增加，而 cAMP 结合的 RIα 更容易发生 LLPS。与此观察结果一致的是，PKAcat 在体外与 RIα 抑制剂和 cAMP 混合时形成液滴，但其自身不形成液滴。这些结果提示，cAMP 动力学决定了 RIα 相分离体的形成和溶解，PKAcat 与 RIα 能够共相分离。

图片来源：Cell

RIα 在 cAMP 信号作用下形成生物凝聚体，为 cAMP 的空间区隔化提供精准调控

在此部分研究中，该团队设计了针对内源性蛋白质的一种基于荧光共振能量转移 (FRET) 的荧光传感器 (FluoSTEPs)，通过对 RIα 荧光斑点形成期间 PKA 活性和 cAMP 动态的变化的监测，研究发现在表达 PKA 催化亚基的 293-RIα 细胞中，Forskolin (Fsk) 诱导荧光斑点的形成；同时，在新形成的 RIα 荧光斑点中，Fsk 诱导的 FluoSTEP-ICUE 反应较大。

鉴于在 RIα 的生物分子凝聚体中观察到的高水平 cAMP，该研究假设这些物质通过充当一个动态缓冲系统来帮助 cAMP 的区隔化。用一种改进的 cAMP 传感器（ICUE4）融合到 PDE4D2（PDE4D2cat）的催化部分来监测 PDE 室中的 cAMP 含量，作为 cAMP 区隔化的直接分析方法，研究发现 Fsk 使标准化的青色 / 黄色发射比仅增加了 6.2%，而用 PDE4 选择性抑制剂 rolipram 和一种通用 PDE 抑制剂 3 - 异丁基 - 1 - 甲基黄嘌呤（IBMX）则完全阻断 PDE 活性，也就是说 PDE4D2cat 在信号调控过程中条件下，当空间区隔化调控系统完好时，可以形成一个 cAMP 区隔流。

此外，使用染料标记的 cAMP 的实验表明，cAMP 本质上是「被困」在 RIα 生物分子凝聚体中。总的来说，这些结果突出了 cAMP 区隔化的关键机制，不足 1% 细胞体积的 RIα 液滴，可以招募大约 99% 的细胞内 cAMP，确保其在细胞内 cAMP 信号特异性。

图片来源：Cell

图片来源：Cell

RIα 相分离的中断破坏 cAMP 的区隔化，导致细胞增殖和转化程度增加

鉴于 RIα 的液 - 液相分离对于实现 cAMP 分隔至关重要，该研究预测 DnaJB1-PKAcat 诱导的 RIα 的液 - 液相分离失调将导致 cAMP 区隔化发生缺陷并造成紊乱。研究采用 PDE4D2cat-ICUE4 cAMP 区隔化测试了 DnaJB1-PKAcat 的效果。

研究发现，在表达野生型 PKAcat 和 RIα 的细胞中，当 RIα 的液 - 液相分离受到干扰时，在相同的条件下，Fsk 不会引起 PDE4D2cat-ICUE4 的蓝绿色 / 黄色发射比的可检测变化，但是会导致蓝绿色 / 黄色发射比的大幅增加。广泛存在的 DnaJB1-PKA 融合蛋白的确会破坏细胞内 RIα 的液 - 液相分离，进而使得 cAMP/PKA 信号通路失调。也就是说 DnaJB1-PKAcat 对 RIα 的液 - 液相分离的破坏显著损害了 cAMP 的区隔化，为癌蛋白融合引起的异常信号传导提供了机制线索。

为了测试缺失 RIα 的液 - 液相分离功能的后果，研究使用非致瘤性肝细胞 AML12，在该细胞系中稳定表达了野生型或各种突变型的 RIα，通过测量它们的增殖率和转化能力，研究发现与野生型细胞相比，缺失 RIα 可使细胞增殖和 DNA 合成增加 2 倍。在 RIα 缺失细胞中，重新表达野生型 RIα 可以挽救野生型的表型，而稳定表达液 - 液相分离或 cAMP 结合缺陷的 RIα 突变体不能挽救野生型表型。RIα 的液 - 液相分离的缺失和 cAMP 区隔化的破坏导致肝细胞的致瘤表型，在小鼠胚胎成纤维细胞中也观察到类似的结果，表明 RIα 的液 - 液相分离的抑瘤特性具有广泛的意义。这一发现揭示了 FLC 可能的发生机理，以及不受控的 cAMP 导致癌症发生的可能机制。

图片来源：Cell

研究总结：

综上所述，该研究发现了一种无膜细胞器结构，它参与调控 PKA 信号通路，所取得的研究结果代表了在理解 cAMP/PKA 途径如何动态协调信号转导的概念性飞跃，并发现了 cAMP/PKA 信号转导失调与癌症发生之间的联系。

总的来说，该研究展示了信号调控的复杂性以及生物分子凝聚体对小分子第二信使的空间区隔作用，凸显其在信号调控中的重要性。