大海捞针—如何在动物组织样本中发现分枝杆菌DNA
结核病(TB)是一种人畜共患病,在世界范围内对人类和动物都具有重要意义。它仍然是世界上许多地方的一种流行病,每年造成近150万人死亡,其中大多数是在发展中国家。
人类结核病主要由结核分枝杆菌引起,而牛分枝杆菌和卡普雷菌是牛结核病的致病因子。这三种病原体都属于结核分枝杆菌复合物(MTC),不仅能引起人和牛的结核病,也能引起其他哺乳动物的结核病。
直到20世纪下半叶,牛结核病在德国很普遍。由于有效的控制和根除运动,1996年,欧洲委员会宣布德国“正式无肺结核”(OTF)。长期的根除计划表明,在发达国家对牛奶进行巴氏杀菌也能减少人牛间质瘤和卡普雷支原体感染。
自2008年以来,在巴伐利亚阿尔卑斯山,牛和马鹿的牛结核病病例一直在发生。巴伐利亚阿尔卑斯山地区是一个有大量牛夏季牧场的地区。这些夏季牧场上的牛可以从马鹿身上感染,这种反刍动物被认为是bTB的宿主。
牛结核病可以表现为一种急性或慢性传染病,具有较长的亚临床期,在这种疾病中,受感染的动物没有临床症状,并且在数年后有可能重新出现。感染后,病原体隐藏在巨噬细胞内并持续存在,通常宿主免疫系统会形成结核样肉芽肿,以防止这些病原体的进一步传播(图1)。病变中心的细菌不繁殖,但可能保持休眠,由此产生的潜伏感染可能持续数年。免疫抑制可以扰乱宿主控制和药剂传播之间的平衡,允许沉默的病原体随着感染的重新激活和传播而复制。然而,在动物中,这种感染的普遍表现比在人类中不太常见。
bTB的诊断具有挑战性。感染bTB后,个体可能会出现不可见的病变,这与通常在淋巴组织中发现的典型肉芽肿形成形成相反。分枝杆菌感染有时只是非常小的肉芽肿或微小的病变,特别是在感染的早期阶段,很难发现
因此,在牛体内检测bTB的诊断程序具有挑战性,成本高昂,目前是基于权威机构规定的协议。用结核菌素皮肤试验或干扰素γ释放试验测定细胞免疫反应,以指示活体动物的感染状态。在动物死亡后,应通过细菌培养直接检测病原体或用PCR检测其DNA,以确认免疫应答。
对于作为后续PCR模板的DNA提取,通常只使用非常少量的米粒大小的组织。由于分枝杆菌在组织材料中的分布不均匀,这可能导致假阴性结果。此外,在早期肉芽肿形成状态下感染的动物根本不显示肉芽肿(不可见的病变)。
这种情况使得我们无法识别分枝杆菌在器官中的存在和定位,从而进行有针对性的DNA提取——选择足够的、含有细菌的组织样本就像大海捞针。
因此,在我们的研究中,我们使用了一块磁铁,把它扔进干草堆里去寻找针头(=MTC-DNA)。我们处理了非常大的样本量,以增加将分枝杆菌DNA纳入调查样本的概率,并使用磁捕获原理将MTC-DNA从大样本池中集中出来(图2)。在第二种方法中,磁性捕获方案中剩余的沉淀物通过一种可用于日常常规诊断的不太复杂的DNA提取协议进行进一步处理。
当我们新开发的MTC-DNA检测应用于动物组织样本时,使用大样本量(最多15克)可提高灵敏度。当我们分析了来自34头牛和18只马鹿的100份组织样本时,这两种新方法都提高了检测率,结果与德国当局规定的方案相比更为优越。