IF:29！华西刘玉、陈崇伉俪报道染色体缺失促进肿瘤发生的新机制，除了P53还有它

背景介绍

染色体拷贝数变异 (Copy Number Variations, CNVs)，是人类癌症的一个常见特征。越来越多的证据表明，一些 CNVs 可能发生在肿瘤发生的早期阶段，这表明某些肿瘤相关 CNVs 可能是肿瘤发生的驱动因素。

有研究表明，抑癌基因在染色体缺失区域富集，而原癌基因则在染色体扩增中富集。鉴于每个 CNV 都涉及大量基因，因此，从功能上识别潜在的抑癌基因和原癌基因，能够更好地了解 CNVs 在癌症发生中的机制。

在所有 CNVs 中，杂合性染色体 17p 缺失 (del(17p)) 是实体肿瘤和造血系统恶性肿瘤 (包括淋巴瘤和白血病) 中最常见的染色体丢失。长期以来，人们一直认为 del (17p) 的唯一作用是导致 TP53 杂合性缺失。

然而，17p 区域是否存在其他抑癌基因以及其潜在的功能又是什么？

2020 年 9 月 25 日，来自四川大学华西医院的刘玉、陈崇团队合作在国际著名期刊 CANCER DISCOVERY（IF=29.5）在线发表题为 An epigenetic mechanism underlying chromosome 17p deletion-driven tumorigenesis 的研究性论文，该研究利用多种功能遗传策略，鉴定出一个新的 17p 肿瘤抑制基因 —— PHD finger protein 23 (PHF23)，研究发现，PHF23 的丢失会损害 B 细胞分化并促进未成熟的 B 淋巴细胞恶性肿瘤的发生。机制层面上，他们发现 PHF23 可通过 N - 末端直接与 SIN3-HDAC 复合物结合，并抑制其在 H3K27ac 上的去乙酰化活性。

图片来源：CANCER DISCOVERY

研究内容

PHF23 为单倍剂量不足的抑癌基因

首先，研究人员通过无偏颇的体内肿瘤发生因素的筛选中发现多个靶向 PHF23 的 shRNA 在淋巴瘤 / 白血病中富集。通过进一步分析 TCGA 数据库中弥散大 B 细胞淋巴瘤 (DLBCL) 的样本信息，他们发现，del(17p) 组的 PHF23 表达显著降低，这与 DNA 拷贝数丢失的情况一致。因此，研究人员推测 PHF23 可能是 17p 染色体上的一个新的抑癌基因。

为了验证 PHF23 在 B 细胞恶性肿瘤中的作用，他们利用多个独立的 PHF23 shRNAs 和对照肾细胞 shRNA (shRen) 与 GFP 和 Myc 共导入 C57BL/6 小鼠骨髓分离的 pre-B 细胞中。然后将 shPhf23 或 shRen 细胞移植到亚致死照射的同种受体小鼠中。结果发现，shPhf23 的生存周期显著缩短、淋巴结显著增大，并且其肿瘤细胞几乎均为 GFP 阳性细胞。

图片来源：CANCER DISCOVERY

染色体 17p 缺失通常以杂合缺失的形式出现。然而，带有 del (17p) 的 PHF23 突变在人类癌症中较为罕见，不过，del (17p) DLBCL 患者的 PHF23 表达较 17p 染色体完整的患者明显降低。因此，研究人员推测 PHF23 也可能是 17p 染色体上的单倍剂量不足的抑癌基因。

为了验证这一假设，他们通过 CRISPR/Cas9 技术编辑生成 Phf23 敲除小鼠。将 Phf23 野生型、杂合子和纯合子敲除的胎肝细胞经 Myc cDNA 转导，然后移植到亚致死辐照的同种受体小鼠中。结果与上述发现一致，与接受野生型胎肝细胞的小鼠相比，Phf23 杂合子和纯合子敲除组的肿瘤发病时间明显缩短，并且其生存周期也显著缩短，这些结果表明 PHF23 为单倍剂量不足的抑癌基因。

图片来源：CANCER DISCOVERY

PHF23通过结合H3K4me3、H3K27ac发挥作用

有报道表明 PHF23 在其 C - 末端含有一个 PHD 结构域，该结构域被证明与 H3K4me3 特异结合，而 H3K4me3 通常富集于活性启动子上。研究人员通过染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq) 研究了野生型 PHF23 在小鼠 pro/pre-B 细胞系 (29)Ba/F3 细胞中的功能，发现超过 90% Phf23 结合峰与 H3K4me3 峰重叠。同时，与 shRen 细胞相比，Phf23 敲除的 pre-B 细胞下调的基因比上调的基因更明显 (153 vs. 14)。这些结果均表明，PHF23 与 H3K4me3 共定位并协同调控基因的激活。

图片来源：CANCER DISCOVERY

为探索 PHF23 是如何调控基因表达的，研究人员进行了免疫共沉淀质谱 (Co-IP/MS) 分析，以确定潜在的 PHF23 结合靶点。结果发现，富集度最高的是 SIN3 转录调节家族成员 a 和 b (SIN3A 和 SIN3B)，SIN3 是 SIN3- HDAC 复合物中的主支架蛋白，它可以抑制转录，并参与各种生物和细胞过程。

SIN3-HDAC (组蛋白去乙酰化酶) 复合物包含多个紧密相关的成分，在 Co-IP/MS 检测分析中，所有这些紧密相关的成分都与 PHF23 发生了免疫共沉淀，包括该复合物的核心催化蛋白 HDAC1 和 HDAC2，后续的验证实验也证实了上述分析结果。

这些结果表明 PHF23 直接与 SIN3-HDAC 络合物相互作用，形成 PHF23-SIN3-HDAC (PSH) 复合物，以发挥基因调控的作用。

图片来源：CANCER DISCOVERY

PSH复合物在肿瘤发生过程中发挥重要作用

PHF23 包含多个功能域，那 PHF23 与 SIN3-HDAC 是通过什么进行结合的呢？

研究人员利用 PHF23 截断的突变体检测了 PHF23 的哪个区域与 SIN3-HDAC 复合物相互作用。结果发现卷曲线圈和 PHD 结构域的截断 (∆CC 和∆PHD) 都没有影响 PHF23 与 SIN3A 和 HDAC1 的结合。然而，N 端截断 (∆N) 完全中断了 PHF23 与 SIN3A-HDAC1 的相互作用，表明 PHF23 是通过其 N 段与 SIN3-HDAC 复合物进行结合的。

图片来源：CANCER DISCOVERY

考虑到 PSH 在组蛋白修饰和基因调控中的重要性，研究人员进一步探索了该复合物是否在淋巴瘤 / 白血病的发生和维持中发挥重要作用。结果发现，敲除 Sin3a 完全阻断了 Phf23^+/- 诱导的淋巴瘤 / 白血病的发生，同样，Sin3b 缺失也显著延长了 Phf23^+/- 移植小鼠的无瘤生存。

图片来源：CANCER DISCOVERY

上述结果表明 PSH 复合物对肿瘤的发生至关重要，那么其在肿瘤维持中又发挥怎样的作用呢？

研究人员通过 shRNA 降低了 Sin3a 在 shPhf23 淋巴瘤 / 白血病细胞和 Ba/F3 细胞中的表达，结果显示，Sin3a 敲低特异性地损害了 Phf23 缺失组淋巴瘤 / 白血病细胞的生长，但对 Ba/F3 细胞影响轻微，Sin3b 的敲低亦得到相似的结果。此外，与 shRen 相比，Hdac1 shRNAs 显著降低了 Phf23 缺失组淋巴瘤 / 白血病的存活。另外，HDAC 抑制剂 Entinostat、Mocetinostat 和 Chidamide 可特异性诱导 shPhf23 组淋巴瘤 / 白血病细胞死亡，但在给定浓度下不能诱导对照 Ba/F3 细胞死亡，这表明 这些小分子对 Phf23 缺陷肿瘤的潜在治疗剂量。

图片来源：CANCER DISCOVERY

最后，考虑到 PHF23 的 N 端是介导 PSH 复合物形成的关键区域，他们将全长或其他 PHF23 突变体引入 PHF23 缺陷肿瘤细胞中。结果表明，全长 PHF23 特异性抑制 PHF23^+/- 淋巴瘤 / 白血病，而对 Ba/F3 细胞无显著作用，进一步证实了 PHF23 是一种真正的抑癌基因，而 N 端缺失 PHF23 则完全丧失了其抑瘤功能， 这强烈暗示了 PHF23 N 端介导的 PSH 复合物是维持肿瘤的必要条件。

图片来源：CANCER DISCOVERY

研究总结

该研究首先确定 PHF23 是一个 17p 的抑癌基因，它的丢失对肿瘤的发生和肿瘤的维持都是至关重要的。PHF23 与活性组蛋白标记物 H3K4me3 共定位，通过 N 端直接结合 SIN3-HDAC 并形成 PSH 复合物，PSH 复合物为 H3K4me3 和 H3K27ac 之间的基因激活提供了协同作用，尤其是抑癌基因和分化基因。

总之，这项研究揭示了肿瘤发生中一种新的表观遗传调控机制，它有助于 17p 缺失肿瘤的内在机制研究，并提示了这类疾病新的易感性。

图片来源：CANCER DISCOVERY

(TSG, tumor suppressor gene)

刘玉教授、陈崇教授为该研究的共同通讯作者。不仅如此，2016 年，两人并列共同第一作者在 Nature 发表题为 Deletions linked to TP53 loss drive cancer through p53-independent mechanisms 的研究性论文，表明 17p 缺失带来的表型超出了仅通过 TP53 缺失展现出的表型；同时还证明染色体片段缺失事件可能是由于破坏多个基因的选择性优势而产生的，并提供了一个解剖那些常见、但尚未得到充分研究的促癌病变机制的新的视角。

图片来源：Nature

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