基本方案

如果某一待测缺失突变株能和一种已知缺失突变株进行重组,表明这一待测突变的位置一定不在已知缺失区域内。如果不能重组,待测定菌株突变位置便在已知缺失范围内。

菌株A、B、C的缺失区域是已知的,另外有一系列点突变菌株1、2、3和4。分别将它们两两滴加在固体培养基表面的同一位置上,根据是否出现野生型重组子(用+号表示),便可以知道点突变发生的位置。如果A、B、C三个菌株缺失的片段在下图中虚线所表示的范围,那么就可以知道这四个点突变的位置的顺序是1432或1342。这里虚线两端的实线表示的染色体实际上是连接着的

如果另外还有一个缺失菌株D,它的缺失范围也是已知的(缺失位置如图34-2所示),它与待测菌株3滴加在一起时出现野生型重组子,可是和待测菌株4滴加在一起时却不出现野生型重组子,那么可以进一步证实突变位点的顺序是1432而不是1342。由此可见,只要有足够多的缺失菌株,就可以区别十分接近的突变位点。缺失定位不仅可以应用于一般基因定位的研究,而且还可以应用于一个基因的突变位点的定位,即基因的精细结构分析。

缺失定位不仅可以用选择性培养方法提高效率,而且所需观察的结果只是能或不能重组,无须观察统计重组子的数量。因此这种基因定位方法不但效率高,而且比较准确。当然,应用这种方法事先需要获得一套缺失突变菌株。

本实验进行lacZ基因内精细结构的定位。采用一套已知在大肠杆菌染色体lacZ基因内发生了无义点突变的F-菌株和一套在F′上带有lacpro染色体片段,并且在其中lacZ基因上发生了不同长度缺失的菌株。由于实验所用的F-菌株为trp-strr,而带F′的供体菌为strs,所以可在含乳糖的基本培养基中加入色氨酸和链霉素以选择受体菌,并排除供体菌。应用滴加杂交技术在这种培养基上能很方便地观察,分析出这两套菌株lacZ基因中发生突变的位置或发生缺失的长度,即对点突变或缺失突变定位。

1.将供体菌和受体菌接于5mlLB培养液中,30℃培养振荡过夜。

2.在30℃或37℃中放置过夜的比较干燥的含乳糖、色氨酸和链霉素的基本培养基上进行滴加杂交试验,每组12皿。将每个平板按34-3图分成9格,各标上12、13、14、…、19,第9格标上①或②、③、④、…、1及空白对照。12～19分别为供体菌CSH12、CSH13、……、CSH19,圈内的号码为受体菌株编号。先将受体菌①滴加在平板①的9个区域中,在平板②中滴加受体菌②于9个区域中,直至平板1,空白对照平板不加受体菌。用接种环在每个平板上标有12的区域中滴加供体菌12。每个平板标记区域中均滴加供体菌株12后,再加供体菌株13,直至供体菌株19,空白对照平板不滴加受体菌株,只加供体菌株12～19。待平板表面滴加液干后,置于37℃培养24～48h。

3.观察结果

1.滴加杂交的平板要适当干燥,这样有利用于菌液快速吸干。

2.在滴加有受体菌的平板上再加供体菌,每加一处后接种环必须进行火焰灭菌,以免将一种菌液混入另一杂交区域。