酶类_来自高温厌氧杆菌属的丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶的纯化

研究背景：

Wood-Ljungdahl pathway (WLP) 作为一种古老的碳固定通路，它依赖严格的厌氧微生物产乳酸菌、产甲烷菌、硫化菌和古生菌。在WLP途径中CO／CO₂和氢气为碳源和能源， 合成乙酰辅酶A（acetyl-CoA）， 进行物质和能量代谢

 (acetyl-CoA。产乙酸菌再转化为乙酸。大多数产乙酸菌可以维持无机自养的生命循环，使用H₂和CO作为电子供体固定CO₂生成乙酸。

WLP途径的ATP得失为零，因此根据化学渗透假说，它们需要能量的转化来维持细胞代谢的平衡。自养代谢和异养代谢的中心环节就是乙酰辅酶A。2个关键酶作用于这一环节，分别是一氧化碳脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶 (CODH/ACS)，结合了WLP途径中的甲基和CO，而丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶 (PFOR) 可以还原乙酰辅酶A羧酸盐到丙酮酸。

PFOR是细菌厌氧代谢的关键酶，从低电势的铁氧还蛋白 (Fd₂) 作为电子载体，此酶可以用作酶促反应的辅酶，在需要Fd作为电子受体的反应中，比如电子差异酶，以维持还原性Fd的恒定水平。

图2 T.Kivui中表达非标签&带his标签PFOR基因纯化流程图

实验方法：

在66℃的厌氧条件下培养T. kivui菌，优化微量元素，通H₂和N₂。收集细胞破碎130,000 g离心，4℃ 60 min收集上清。

 

在T. kivui中重组表达non-tagged PFOR和His-tagged PFOR1纯化路线。

PFOR透析到50 mM Tris-HCl，2 mM DTE，4 μM resazurin，20% (v/v) glycerol，pH 8.0进行阴离子交换层析捕获。3-13 mM NaCl 或电导3.8–8.4 mS/cm洗脱。样品加入1 M AMS进行疏水相互作用层析中度纯化，50 mM Tris-HCl，20 mM MgSO₄，2 mM DTE，4 μM resazurin，20% (v/v) glycerol，pH 7.5线性洗脱。50 kDa VIVASPIN 超滤浓缩，衔接凝胶过滤进行精细纯化，50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，20 mM MgSO₄，2 mM DTE，4 μM resazurin，20% (v/v) glycerol，pH 7.5，获得单峰。

PFOR1捕获步骤为镍柱亲和层析，30 mM imidazole洗杂，50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，20 mM MgSO₄，400 mM imidazole，0.5 mM DTE，4 μM resazurin，20% (v/v) glycerol，pH 7.5洗脱，超滤后衔接凝胶过滤精纯。

 

非标签PFOR纯化倍数为50.4，三步纯化的回收率3.6%。His标签PFOR1的纯化倍数为35.8，两步纯化的回收率为93.9%。

 

Reference:

Katsyv et al. Pyruvate:ferredoxin oxidoreductase of Thermoanaerobacter kivui. FEBS Open Bio 11 (2021) 1332–1342