食品科学_基于纳米抗体的免疫技术检测牛奶中金黄色葡萄球菌

食物直接和间接被污染病原体后大大增加了人体感染几率，严重危害人类健康。其中金黄色葡萄球菌 S. aureus 就是一种重要的病原体，食品等相关产品被强制要求检测 S. aureus 菌落数。常用检测手段包括平板计数法、PCR 法、外毒素免疫法等，这些方法具有一定的局限性。文献研究和开发出基于直接针对灭活菌体的纳米抗体（Nanobody, Nb）的免疫检测方法。通过 ELISA 筛选出不与 IgG 的 Fc 片段发生相互作用的菌株 ATCC10832，利用优化的终浓度为 0.5%（v/v）甲醛灭活后的菌体配合佐剂免疫羊驼 7 次，通过采血 50mL 提取外周血淋巴细胞建立 Nb 库。然后通过噬菌体展示的方法，筛选出对 S. Aureus 菌体特异性识别的 Nb 共四个（Nb85、Nb119、Nb147、Nb174）并测序。通过原核细胞诱导表达 HIS 标签和生物素标签的 Nb，然后利用亲和层析和凝胶过滤分子筛两步层析纯化出 Nb 抗体，分子量约 15 kD。并用 thermofluor assay 测试稳定性、ELISA 鉴定 Nb 对 S. Aureus 菌体识别的特异性。以此开发出了双夹心 ELISA 检测技术，利用 His-Nb 包被酶标板捕获、biotinylated Nb 来检测样品中的 S. aureus 菌体，经测试得到检测 LOD 为 1.4×10⁵ CFU/mL，并能够从牛奶中检测出 10 CFU/mL/8h 的 S. aureus 菌体，证明此法能够高效地从食品中检测出 S. Aureus，为后续的产业转化提供研究基础。

实验流程

图 1 直接针对灭活菌体的纳米抗体的免疫检测方法图

实验方法

转化了 Nb 基因的大肠杆菌在 28 度 IPTG 诱导表达 16 h 后，离心收集的菌体经过渗透休克法 osmotic shock 得到周质提取液，HIS 标签的 Nb 第一步层析通过 IMAC 捕获和洗脱，生物素修饰的 Nb 第一步层析通过 Streptavidin 捕获和洗脱，第二步均为 Superdex 75 凝胶过滤层析分离聚集体和单体，并对样品换液，主峰约在 85 mL，分子量约为 15 kD 左右。