中药天然产物_从苤蓝种子中提取抗菌活性的多肽

研究背景

 

苤蓝种子 Brassica oleracea var. gongylodes 浸泡后经过均质化离心得到组织裂解上清液，上清液经过不同分辨率的两步离子交换层析完成初纯和精纯，再流经适合分离多肽的分子筛得到纯度较高的抗菌多肽 Brassica oleracea var. gongylodes Antifungal Peptide，BGAP。纯化后的多肽对常见的十几种植物真菌具有不同程度的抑制生长作用。通过平板生长的测试，发现纯化后的 BGAP 能够对烟草赤星病菌、贵腐霉菌、胶孢炭疽菌和玉米大斑病菌等 12 种植物真菌具有抑制生长作用，但是对细菌一般没有抑制生长的作用。

 

实验流程

 

图一 实验流程图

 

实验方法

 

150 g 苤蓝种子用 1 L 的缓冲液（10 mM NH₄OAc，pH = 4.6）浸泡过夜后进行均质化，然后继续 4 度孵育 12 h，后 10000g 离心 30 min 取上清液，得到原始裂解液。

 

澄清的裂解液经过 SP Sepharose 离子交换层析初纯，层析柱型为 5 cm × 16 cm，结合液 10 mM NH₄OAc buffer (pH = 4.6)，用结合液平衡层析柱后将用洗脱液 10 mM NH₄OAc buffer （pH = 4.6）和 0.2 mol/L，0.5 mol/L，1 mol/L NaCl分步洗脱。分离的组分经过抗真菌活性鉴定，目标抗菌多肽在 0.5 mol/L NaCl 洗脱下来。

 

澄清的裂解液经过 SP Sepharose 离子交换层析初纯，层析柱型为 5 cm × 16 cm，结合液 10 mM NH₄OAc buffer（pH = 4.6），用结合液平衡层析柱后将用洗脱液 10 mM NH₄OAc buffer（pH = 4.6）和 0.2 mol/L，0.5 mol/L，1 mol/L NaCl 分步洗脱。分离的组分经过抗真菌活性鉴定，目标抗菌多肽在 0.5 mol/L NaCl 洗脱下来。

 

经过两步离子交换层析纯化的样品，最后利用 Superdex peptide 10/300 分子筛精纯，抗菌活性的多肽在约进样后的 14 mL 流出。

 

纯化后的抗菌多肽经过质谱进行为分子量为 6—10 kDa 左右的多肽混合物。