单细胞/微量核酸扩增方案

单细胞测序可以研究单个细胞内的基因情况，同时解决了用组织样本测序无法解决的细胞异质性难题。但是我们常提到的单细胞测序方案并不是仅对单个或者几个细胞进行测序，而是在单细胞分辨率下对成千上万个细胞进行测序。那么如果真的只有一个细胞或极微量的核酸，又该采用什么手段对其基因组和转录组进行分析呢？单细胞/微量核酸扩增方案可以富集核酸样本，应对后续各种分子研究。

基于 MDA（多重置换扩增）技术，支持从单细胞或微量 DNA 开始进行全面均一的基因组扩增（针对 RNA 扩增需要先反转录成 cDNA，详情请咨询工作人员）。MDA 扩增技术依靠的 Phi 29 聚合酶是一种特殊的 DNA 聚合酶，其能够以基因组 DNA 作为模板而实现长达 100 kb 的连续扩增，并可保证不从基因组模板上脱离。相对于传统 PCR 的扩增方法，Phi 29 聚合酶因具有 3'→5'的外切酶校准活性而在扩增时具有比 Taq 聚合酶高 1000 倍的保真性。MDA技术在耐受外切酶活性引物存在的条件下可实现对多种哺乳动物以及细菌DNA 的高产量扩增。扩增产物后续可用于 NGS、三代测序、芯片、PCR 等多种分析方案。

REPLI-g Single Cell Kit (QIAGEN)

Vortex 漩涡震荡仪

PCR仪

1. 从单细胞样本中扩增全基因组 DNA

1.1 根据需要进行的全基因组扩增反应数准备足够的变性工作液 2（参照表 1）

注意：表 1 中的变性工作液 2 量足够 12 次反应，剩余的变性工作液 2 可以在 -20℃保存不超过 3  个月。

1.2  将 4 μL 的起始细胞样本液（保存于 PBS 中）加入到一微型离心管中。如果起始细胞液体积少于 4 μL，则通过加入 PBS sc（磷酸盐缓冲液）使得终体积至 4 μL。

1.3  加入 3 μL 的变性工作液 2，并通过轻弹离心管及简短离心来均匀混合各种液体。

1.4  在 65℃ 条件下孵育 10 min。

1.5  加入 3 μL 的 Stop Solution（终止液），通过轻弹离心管及简短离心来均匀混合各种液体后，置于冰上。

1.6  将 REPLI-g sc DNA Polymerase（DNA 聚合酶）置于冰上解冻，并将其他试剂在室温解冻，涡旋后简短离心。

1.7  根据表 2 来准备预混液，混匀后简短离心。

1.8  对于每个反应，在 10μL 的变性 DNA 溶液（1.5 步后）中加入 40 μL 的上述预混液。

1.9  30℃ 孵育 8 h。

1.10  将 REPLI-g sc DNA Polymerase（DNA 聚合酶）在 65℃ 失活 3 min。

1.11  如果不需要立即使用，可将扩增后的 DNA 放在 4℃ 短期保存或放置在-20℃长期保存。扩增后的 DNA 产量一般在 40 μg 每 50μL 反应，并且需要按照一定的适当比例进行稀释。光学浓度（OD）测定会高估扩增 DNA 的产量。

2. 对纯化后的基因组 DNA 进行全基因组扩增

2.1  根据需要进行的全基因组扩增反应数准备足够的变性工作液 1（参照表 3 和表 4）

注意：表 3 和表 4 中的变性工作液 1 和中和缓冲液量足够 12 次反应，剩余的变性工作液 1 和中和缓冲液量可以在-20℃ 保存不超过 3 个月。

2.2  将 2.5 μL 的模板 DNA 加入到一微型离心管中。

2.3  加入 2.5 μL 的变性工作液 1，漩涡并简短离心。

2.4  在室温孵育 3 min。

2.5  加入 5 μL 的中和缓冲液，涡旋并简短离心后置于冰上。

2.6  将 REPLI-g sc DNA Polymerase（DNA 聚合酶）置于冰上解冻，并将其他试剂在室温解冻，涡旋后简短离心。

2.7  根据表 5 来准备预混液，混匀后简短离心。

2.8 在 10 μL 的变性 DNA 溶液（2.5 步后）中加入 40 μL 的上述预混液。

2.9  30℃ 孵育 8 h。

2.10  将 REPLI-g sc DNA Polymerase（DNA 聚合酶）在 65℃ 失活 3 min。

2.11  如果不需要立即使用，可将扩增后的 DNA 放在 4℃ 短期保存或放置在-20℃长期保存。扩增后的 DNA 产量一般在 40 μg 每 50μL 反应，并且需要按照一定的适当比例进行稀释。光学浓度（OD）测定会高估扩增 DNA 的产量。

1. 该操作步骤针对各种来源的单细胞扩增而优化的，比如分选细胞、组织培养细胞以及细胞系等。该操作步骤不适用于经福尔马林或其他交联试剂固定过的细胞，如来源于福尔马林固定、石蜡包埋组织样本的激光显微切割单细胞样本。

2. 大约 40μg 的 DNA 产物也会存在于经过单细胞扩增反应的阴性（无模板）对照中，这些产品是反应体系中引物二聚体经过随机延伸而得到的高分子量扩增产物。这些 DNA 并不会影响实际扩增样本的质量，也不会在下游检测过程中产生阳性结果。

3. 其他样本类型也适用于此方法，包括：

 4. 除了全基因组扩增，基于 MDA 的技术也支持靶向区域扩增，如针对线粒体 DNA 的特异性扩增。

内容来源： QIAGEN 凯杰