🔥 蛋白质的真核表达——哺乳动物体系

蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，载体中含有外源的基因片段，通过载体介导，目的是实现外源基因在宿主中的表达，本文以用于小鼠及兔源 IgG 的通用型二抗 PA/G-HRP 融合蛋白的真核表达为例进行表述。

全基因合成金黄色葡萄球菌蛋白 A（SPA）、链球菌蛋白 G（SPG）与辣根过氧化物酶（HRP）融合基因片段，定向克隆至真核表达载体 pcDNATM3.1 骨架中，瞬时转染入人胚肾 HEK293F 细胞进行表达，通过 SDS-PAGE、 Western blot 法鉴定融合蛋白表达情况。

实现多功能蛋白的稳定且高效制备，得到纯度高、均一性好的产物。 

仪器：

恒温摇床、离心机、电泳仪

蛋白凝胶显影仪、涡旋仪

试剂：

HEK293F 细胞、限制性内切酶 EcoRⅠ

BamHⅠ

pcDNATM3.1（-） 真核表达载体

HyCloneTM CDM4HEK293TM 无血清培养液

HyCloneTM HyCell TransFx-HTM 培养液

牛血清蛋白BSA、FectoPRO 转染试剂盒

考马斯亮蓝

1、pPA-HRP、 pPG-HRP 和 pPA/G-HRP 质粒的构建：

将已知 PA、 PG 和 HRP 的氨基酸序列按照密码子偏好性进行拟合，由公司进行基因合成。合成序列以 EcoRⅠ 和 BamHⅠ 酶切位点导入 pcDNATM3.1（-） 真核表达载体，测序正确质粒分别命名为 pPA-HRP、pPG-HRP 和 pPA/G-HRP。

2、pPA-HRP、 pPG-HRP 和 pPA/G-HRP 在 HEK293F 细胞的表达：

HEK293F 细胞使用 HyCloneTM CDM4HEK293TM 无血清培养液于 80 mL/L CO₂，37 ℃，120 r/min 细胞培养摇床中培养。调整细胞数为 （1~1.5）×10⁶ 个/mL 时，将细胞转移到 HyCloneTM HyCell TransFx-HTM培养液中。

参照 FectoPRO 转染试剂说明书，将构建好的真核表达质粒 pPA-HRP、pPG-HRP 和 pPA/G-HRP 瞬时转染到 HEK293F 细胞中，置于细胞培养摇床上继续培养。6 d 后，离心收集细胞培养上清，进行 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。

3、蛋白表达情况鉴定：

细胞培养结束后，2000 r/min 离心 5 min，收集细胞培养上清。加入 5× SDS-PAGE 上样缓冲液，煮沸 10 min，涡旋离心后，进行 SDS-PAGE。电泳结束后，将凝胶考马斯亮蓝染色 3 h；然后，加入脱色液直至条带较为清晰、 背景较为干净为止，根据考染情况对蛋白表达进行分析。

将上述凝胶转移至硝酸纤维素膜上，用含 30 g/L BSA 的 TBS 溶液室温封闭 1 h，使用 HA 标签抗体检测 PA-HRP、 PG-HRP 和 PA/G-HRP 融合蛋白的表达。

在选择载体时常用的大肠杆菌 E.coli 表达系统经济实惠，但由于缺乏重要的脂类及分子螫合物，用于表达真核蛋白可能会影响蛋白本身的部分功能。