🔥 稳转细胞系的构建

慢病毒转染是一种常见的，在一种细胞系中稳定敲除/表达某种基因的方式。

稳转株全称是稳定表达细胞株，通常是指基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系，通过慢病毒感染能够将外源 DNA 克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，从而筛选得到可稳定表达目的蛋白或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。

构建稳定转染（简称：稳转）的敲低/过表达细胞系。

慢病毒及病毒感染增强液、移液枪、枪头、Ep 管、细胞培养孔板、无血清 DMEM，完全培养基、废液缸、口罩、手套。

1、准备：在转染之前将细胞接种于适当的孔板之中，使转染时细胞的汇合度约为 20%~30%，培养 16~24 h。

2、转染：在细胞对数增长期向孔板中加入适当体积的病毒及转染试剂，先用无血清培养基培养 8 h~12 h 后，换成含血清培养基培养。

具体加入量可参考以下表格：

可将病毒及转染试剂按照适当比例加入到完全培基中，再分别加入到各个孔中。每孔的液体体积为：

3、转染后 72 h 可适当对细胞换液，保持细胞活性。

4、可通过观察 GFP 荧光情况判断转染效率，若细胞带有嘌呤霉素抗性基因，可使用嘌呤霉素处理，筛选稳转株。

5、注意事项：GFP 荧光只能说明质粒被转入细胞，具体的过表达/敲低效果需要以 WB 的结果为准。

几个名词的解释：

MOI：复感染指数，指病毒对细胞的感染能力。通常把某株细胞有 80% 被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的 MOI。MOI=（病毒滴度×病毒体积）/细胞数目。

TU/ml：「TU」为「Transducing-Units」的缩写，中文为转导单位，表示可以感染并进入到目标细胞群中的病毒基因组数。TU/ml 指的是每毫升慢病毒液中含有具有生物活性的慢病毒颗粒数。

1、操作时建议使用生物安全柜，若使用普通超净台，请不要打开排风机。

2、操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅，废弃物请专门处理或密封后高温高压灭菌。

3、对于不分裂的细胞，应适当提高铺板密度。

4、注意支原体污染。

1、对于难转染的细胞，可以通过加大病毒用量，或者两次转染的方式处理。

2、对于悬浮细胞的转染，可采用离心感染方法提高感染效率：加入病毒之后，将培养板密封，用平角转子离心机 1000 g 离心 1 h，再放回培养箱中正常培养。换液可通过离心后吸取上清液并加入新的完全培基进行换液。