DiBAC4(3)/EB/PI 染色法检测大肠埃希菌和革兰阴性菌功能

DiBAC4(3)/EB/PI 染色法是联合应用金羊醇类染料双-（1,3 二丁基-巴比妥酸）三甲基金羊醇 ［Di- BAC4（3）］ 和 EB 检测大肠埃希菌和其他革兰阴性菌功能。

DiBAC4(3)/EB/PI 染色法检测大肠埃希菌和革兰阴性菌功能的基本原理是联合应用金羊醇类染料双-（1,3 二丁基-巴比妥酸）三甲基金羊醇 ［Di- BAC4（3）］ 和 EB 检测。金羊醇可作为 AW 的指标，而 EB 当细菌能量代谢受损、外排泵灭活时，可被具有完整细胞膜的细胞保留在胞内。碘化物（PI）是用来证明胞膜通透性的; 一旦 PI 进入细胞, 它可以从核酸中置换 EB, 可能是由于 PI 带有两倍于 EB 的阳电荷而与核酸具有较高亲和力。所有 3 种染料均可被 488nm 激光激活,DiBAC4（3）荧光在绿色（〜525nm）荧光通道检测，而 EB 和 PI 分别在~575nm 和＞630nm 通道检测。

器材：Sanyo MSE150 超声波匀浆仪 (Sanyo, Chatsworth, CA)、流式细胞仪。

试剂：

①DiBAC4（3）（分子探针,Eugene,0R）：金羊醇类需要加碱才能溶解。

②EB（Sigma-Aldrich、St. Louis, MO）

③PI（Sigma-Aldrich）

④Dulbecco 缓冲液（DBS + ）,pH7. 2, 含 0. 1% 蛋白胨,0.1% 琥珀酸钠,0.2% 葡萄糖和 4 mM EDTA

DiBAC4(3)/EB/PI 染色法检测大肠埃希菌和革兰阴性菌功能的基本过程可分为如下几步：

（一）样品准备；细菌超声解聚和染色步骤

A 若为标本在液体介质中，即用 10μL 标本稀释于 200μL DBS +中。若为固体样本先用 DBS +混悬，然后进一步稀释。

B 用 Sanyo MSE150 超声波匀浆仪 (Sanyo, Chatsworth, CA) 以 23kHz 轻柔超声处理的样 品，使细菌刚好以单个菌体存在于液体中。将样品放在 1 个 7 ml 的一次性聚苯乙烯平底管中，把 3 mm 的超声指探头插入 2 ml 样品中，使其尖部位于液下 5 mm, 在 2|xm 振幅下超声样品 2 min。

C 加染料染色：10 μg/ml DiBAC4(3) ,10 μg/ml EB 和 5 μg/ml PI。

D 上流式细胞仪分析前，样本留置 25℃ 30 min。

（二）流式细胞术测定

A 488nm 为激光激发波长。

B 用前向和 (或) 侧向散射信号作为激发信号分析。用软件设门排除因噪声和样本中 污染微粒产生的低水平散射信号。

C 设定检测器滤光器片，以便 PI 荧光在 630nm 之上，EB 荧光在 575nm, 和 DiBAC4（3）荧光在 525nm 可被检测。

D 调整硬件或软件补偿功能，使每种染料在自身通道中测量到其他染料的荧光减到最少。

E 活力测定，单个细胞直接分选至营养琼脂平皿上。