DiOC2（3）和 TO.PRO.3 法检测细胞的 AW 和膜的通透性

DiOC2（3）和 TO.PRO.3 法是应用 DiOC2（3）红色（~610nm）和绿色（〜525nm）荧光比率和 T0-PR0-3 的远红（＞695nm）检测金黄色葡萄球菌和其他革兰阳性菌的 AW 和膜的通透性。

DiOC2（3）和 TO.PRO.3 法检测细胞的 AW 和膜的通透性的基本原理是应用 DiOC2（3）红色（~610nm）和绿色（〜525nm）荧光比率和 T0-PR0-3 的远红（＞695nm）检测。DiOC2（3）在 488nm 可被激发, 并作为∆Ψ的指标,T0-PR0-3 用于确定细胞膜的通透性，可由 He-Ne（633nm）或半导体激光（635 ~640nm）激发。在 T0-PR0-3 荧光信号中扣除 DiOC2（3）绿色荧 光信号作为观察细胞膜通透性的指标要比单独采用 T0-PR0-3 荧光鉴别细胞膜可通透性和不可通透性要好。

试剂：

①DiOC2（3）（分子探针）

②碘化 TO-PRO-3（分子探针）

③羟基氰氯苯踪 (CCCP) ( Sigma-Aldrich)(分子量 204.6)

④乳链球菌素 (Sigma-Aldrich)(分子量 3354) : Sigma-Aldrich 出售的试剂中含 2. 5% 乳链球菌素，其余为 NaCl 和溶解的乳固体; 过滤水溶液一定要稀释至终浓度 25μL/ml。

⑤缬氨霉素 (Sigma-Aldrich)(分子量 111)

⑥Mueller-Hinton 培养基 (GibcoTM Invitrogen 公司,Carlsbad, CA) 含 Ca²⁺ ( MHBc)50 mg/L

DiOC2（3）和 TO.PRO.3 法检测细胞的 AW 和膜的通透性的基本过程可分为如下几步：

（一）样品准备

A 在 MHBc 中把样本稀释至目的浓度 106〜107 个细胞/mL。

B 加染料染色：向样本加入 30μM 的 DiOC2（3）和 100nM 的 T0-PR0-3。

C 上流式细胞仪分析前，样品留置室温（〜25℃）5 min。

（二）流式细胞术测定和数据分析

A 采用 488nm（M 离子或固态激光）和红色（来自 He-Ne 633nm 的激光或来自二极管 接近 635nm 的激光）激光作为激光激发光源。

B 用前向和（或）侧向散射信号作为激发信号分析。用软件设门排除因噪声和细胞碎 片产生的低水平散射信号。

C DiOC2（3）在 488nm 被激发; 其绿色荧光的检测通过 1 个带通为 525〜530nm, 带宽接近 20nm 的滤镜，而其红色荧光的检测采用带通为 610nm, 带宽接近 20nm 的滤镜。

D T0-PR0-3™以红色激光激发，而其远红荧光的检测采用 1 或 2 个 695nm 长带通彩 色玻璃滤镜。