扩增片段长度多态性标记

分子标记（molecular marker）是遗传标记（genetic marker）的一种，是在基因水平上的标记，直接在 DNA 分子上检测遗传变异，用作指示基因组范围变化的多态性标记。分子标记能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制，正是因为这些优点，分子标记的应用越来越广泛。它包括 RFLP、RAPD、AFLP、SSR 等。

长期以来，植物学研究中选择都是基于表型性状、形态学、结构等方面进行的，当性状的遗传基础较为简单或即使较为复杂但表现加性基因遗传效应时，表型选择是有效的。但物种的许多重要表型性状为数量性状，如产量等；或多基因控制的质量性状，如抗性等；或表型难以准确鉴定的性状，如根系活力等。此时根据表型提供的对性状遗传潜力的度量是不确切的，因而选择是低效的。分子生物学技术的发展为植物科学研究提供了一种基于 DNA 变异的新型遗传标记——DNA 分子标记，或简称分子标记。与传统应用的常规遗传标记相比，分子标记具有许多明显的优点，因而已被广泛应用于现代植物研究的各个方面，大量以前无法进行的研究目前利用分子标记手段正蓬勃开展，并取得了丰硕的成果。尤其是当分子标记技术与传统形态结构紧密结合后，正在为植物科学技术带来一场新的变革。

分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为 3 大类：第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）标记、DNA 指纹（DNA fingerprinting）技术、原位杂交（in situ hybridization）等；第二类是以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）反应为核心的分子标记技术，包括随机扩增多态性 DNA（random amplification polymorphism DNA，RAPD）标记、简单序列重复（simple sequence repeat，SSR）标记或简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphism，SSLP）标记、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）标记、序标位（sequence tagged sites，STS）标记、序列特征化扩增区域（sequence charactered amplified region，SCAR）标记等；第三类是一些新型的分子标记，如单核昔酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）标记、表达序列标签（expressed sequences tags，EST）标记等。以下将介绍其中最常用的一些标记技术。

扩增片段长度多态性标记是 1995 年荷兰科学家 Zbaeau 和 Vos 发展起来的一种检测 DNA 多态性的新方法。

AFLP 标记技术的具体过程为：① DNA 提取和质量检测；② 双酶切和酶切片段连接；③ 酶切连接片段的预扩增；④ 选择性扩增；⑤ PCR 产物变性后在聚丙烯酰胺

变性凝胶上电泳；⑥将电泳后的凝胶进行银染显影并拍照保存。

AFLP 技术的特点：AFLP 结合了 RFLP 和 RAPD 的优点，主要表现在以下几点。① AFLP 标记理论上可以无限多，可覆盖整个基因组，不需要预知 DNA 序列信息，呈典型的孟德尔方式遗传。② AFLP 技术能高效地检测出 DNA 的多态性，几乎每对 AFLP 引物都可以扩增出具有多态性的片段，一般一次检测可获得 50~100 个 AFLP 扩增带。③ DNA 用量少，且对模板浓度变化不敏感。④ 可靠性好，分辨率和重复性高。⑤ 引物通用性强。

器材：

各种植物叶片材料、黄豆和蚕豆。

器具：

PCR 仪、移液枪、1.5 mL 离心管、PCR 扩增管、电泳仪、梳子、硝酸纤维素膜、尼龙膜、Bio-Rad 凝胶成像仪、垂直电泳槽、微量加样器、Tip 头、研钵、移液管、离心机。

试剂：

1 mol/L 盐酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bir）、甘氨酸、过硫酸铉、蔗糖、漠化乙锭、漠酚蓝、乙酸联苯胺溶液、过氧化氢、琼脂糖、引物、MgCl₂、dNTP、Taq DNA 聚合酶、PCR Buffer 溶液、硅胶、甲酰胺、SB 缓冲液 100 bp DNA ladder、冰醋酸、AgNO₃ 甲醛、Na₂S₂O₃、ddH₂O。

扩增片段长度多态性标记的基本过程可分为如下几步：

（1）基因组DNA的酶切；人工接头的连接。

（2）AFLP反应：① AFLP反应混合物的制备；② 预扩增反应；③ 选择性扩增反应。

（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：① 5% 变性胶的制备；② 胶板的准备及灌胶；③ 样品的制备；④ 上样；⑤ 电泳；⑥ 银染。