长度多态性分型

长度多态性是个体遗传特征在群体中的反映，对个体遗传标记的表型或基因型分型的技术方法分为限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length polymorphism，RFLP）和扩增片段长度多态性（Amplification Fragment Length Polymorphism，Amp-FLP）。

1.限制片段长度多态性

限制片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms）是指DNA限制性酶识别序列核苷酸结构发生改变，导致酶切位点产生、消失或移位，酶切所产生的限制性片断数目及长度发生改变所生呈现的DNA多态现象。

上世纪70年代，Wyman和White首先报道人类14号染色体上限制性片段长度多态性RFLP，由于DNA序列的改变甚至一个核苷酸的变化，引起某个限制性内切酶切点的丢失或产生移位，导致酶切片段长度的变化而产生多态性。不同个体酶切片段长度在0.5-20kb之间。

RFLP标记具有很多优点：无表型效应，其检测不受环境和发育阶段的影响；RFLP标记在等位基因之间是共显性的，在配制杂交组合时不受杂交方式的影响；在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互不干扰；RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，在数量上几乎不受限制。

但RFLP也存在许多局限性：现有的限制性内切酶不可能检出所有的核苷酸改变；酶切所产生的不同长度的酶切片段所能提供的多态信息量有限；不适用降解和微量检材的DNA分析；早期重组探针需用对身体有害的放射性同位素（32P）标记和Southern杂交技术，后虽改用生物素、地高辛、以及碱性磷酸酶连接人工合成寡核苷酸探针，但灵敏度和重复性均不如同位素。

法医RFLP分析的是基因组小卫星DNA，根据探针特性有两种类型。一种是多基因座探针（muoti-locus probe，MLP），可以同时与多个小卫星的VNTR杂交，形成多基因座RFLP图谱，称为DNA指纹（DNA fingerprint）。另一种是单基因座探针（single-locus probe，SLP），仅与一个小卫星基因座的等位片段杂交，形成单基因座RFLP图谱，称为DNA纹印（DNA profile）。

2.扩增片段长度多态性

扩增片段长度多态性（amplification fragment length polymorphism，Amp-FLP）指通过PCR扩增对基因组中有长度多态的基因座分型。

根据PCR原理，针对具有长度多态的串联重复序列的侧翼序列设计一对引物，PCR扩增后，电泳分离PCR产物。杂合子扩增产物为两条长度不等的片段，纯合子为一条片段。

Amp-FLP分析技术充分发挥了PCR技术的高灵敏度和串联重复序列高多态性的优势，在检测灵敏度、准确性、技术程序上比RFLP优越，使法医DNA分析实现了高效、灵敏、准确的目标。在法医工作中应用最多的是短串联重复序列（short tandem repeats，STR）分型。

⑴ STR遗传标记

1994年，Holly A等人在人类基因组中发现二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸的多态性重复，它由2-6个碱基组成特异序列，重复排列称为短串联重复序列（Short Tandem Repeat，STR，人类基因组的STR单核苷酸重复以PolyA、PolyT多见，双核苷酸以（CA）n，（CT）n，（AA）n，（GG）n常见。

三核苷酸重复以（CXG）n常见，还有大量的四核苷酸重复。STR在染色体的分布情况，根据GenBank等数据库的资料统计，23对染色体上至少分布着7901个STR基因座，估计平均每15kb就分布着一个STR基因座。随着认识的进展，STR基因座的数目还会增加。目前对STR的认识内容主要包括所在染色体区段位置、碱基重复数目、理论上可能的等位基因数、最大杂合性等STR产生的机制。

小卫星DNA重复顺序的产生可能是由于有丝分裂、减数分裂期间同源染色体不对等交换或染色体内部不对等交换的结果。而微卫星DNA重复顺序的产生则普遍认为是DNA复制过程中滑动，或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失，微卫星DNA自发突变率仅10-4-10-5。

STR的命名： STR的多态性一般指由于核心序列重复次数不同而构成的长度多态性。1993年，国际法医血液遗传学DNA鉴定委员会（the DNA commission of the international society of forensic haemogenetics，ISFH）建议用核心序列重复数命名STR的等位基因，用小数点后的数字表示不完整核心序列的bp数，这样命名会使作者在报道STR基因座时可使用两条互补链中的任意一条，由于阅读序列的起始点不同，使对同一重复序列的核心序列命名不同。

故1997年，ISFH再次召开国际会议讨论STR基因座的命名。会议通过DNA的命名从5' 到3' 方向阅读，编码蛋白质的基因内的STR以蛋白质编码链为准，与蛋白质编码基因无关的STR基因座以最初公开发表的资料使用的链为依据命名，并且建议以5' 端第一个包含在重复序列中的核苷酸开始定义命名STR基因座。

STR筛选应先建立基因组DNA文库，用已知的微卫星DNA作探针，筛选DNA文库，最后进行测序分析等过程。微卫星DNA的筛选，多采用M13噬菌体文库，基因组DNA先经一种或数种4碱基识别位点的内切酶切割，通过琼脂糖凝胶电泳，回收300-500bp的片段，与载体相连。选择适当DNA片段是为了使得整个插入片段相同时，测序分析确保包含微卫星的任何阳性克隆被发现。一个适用的微卫星DNA位点应有完整的重复顺序，侧翼区应≥15bp，并适于作为PCR的扩增引物。当一个新的微卫星DNA被发现后，需进行多态性分析和杂合度测定，并且通过与已知多态性遗传标记的连锁分析来确定其在染色体上的位置。

对一个新的STR遗传标记需进行一系列指标评估，包括：

①这个STR遗传标记是否具有孟德尔遗传特征；

②染色体定位是否清楚；

③与其他STR遗传标记是否连锁；

④PCR扩增这个STR遗传标记是否容易完成；

⑤电泳分型结果是否准确，这个STR遗传标记的PCR产物有无异常电泳行为；

⑥基因型在群体中的分布是否处于Hardy-Weinberg平衡；

⑦群体的等位基因频率分布是否阐明；

⑧突变率是否足够低；

⑨同一个个体不同的器官组织STR分型结果是否一致；

⑩个体识别力和非父排除率是否足够高。

从法医学应用角度进行评估至少应考虑：

①种属特异性；

②复合扩增潜力；

③分析陈旧斑痕检材的能力。

STR基因座的特点：

在人类的常染色体、X和Y性染色体上都分布有STR.常染色体STR呈共显性遗传。STR基因座的特点，表现在以下几个方面：

①已发现的STR基因座数目多， 每个STR基因座上有多个等位基因；

②PCR-STR扩增成功率高，STR扩增片段短，一般小于500bp，尤以300bp以下的扩增片段居多，易于扩增。因此陈旧、降解的检材也可以得到很好的扩增；

③STR在基因组中分布广泛、等位基因多、杂合度高，多个STR基因座联合检测时，个体识别力和非父排除率很高；

④STR基因座扩增后基因型之间相差碱基数目少，一般小于5bp，易同时有效扩增；提高了微量生物检材的有效利用；

⑤多个STR基因座，扩增条件大致相同，可以复合扩增；

⑥PCR-STR扩增的灵敏度很高，所需的模板DNA量少，特别适用于各类刑事案件现场所提取微量物证检材的DNA检验；

⑦PCR-STR的检测程序易实现全部自动化，有利于DNA分型标准化后计算机存储、联网等一系列标准化管理的实施，可以成为今后各类刑事案件串、并案的有效手段之一。

STR目前广泛应用于法医的个体识别、亲权鉴定、做为骨髓移植植活诊断的指标、基因作图、筛选目的基因、利用其多态性研究物种起源、种族和民族间的遗传距离。STR为共显性遗传，有丰富的多态性，绝大多数不受选择压力的影响，且较均匀地分布在人类基因中。将STR作为基因作图的标志，就可用STR标识人类基因组描绘基因图；通过家系和/或对照研究，运用连锁和相关分析，我们可以找到与疾病高度相关的STR基因座，假定不同的STR等位基因与目的基因连锁，由于连锁的基因位置必定在同一染色体上且位置与此STR等位基因邻近，利用对疾病高度相关的STR基因座知识，对其附近区域进行克隆测序，就可能发现目的基因。目前知道Huntinton舞蹈症、脆性X综合症、脆性XE综合症、脊髓性肌肉萎缩、肌强直营养不良、Ⅰ型小脑共济失调6种疾病与三体STR重复序列有关。

任何一种多态性遗传标记在应用前，必须获得群体遗传学的有关资料，调查群体各种基因及基因型的频率及其变化规律。由于同一种遗传标记在不同的种族、民族、地区的人群中的多态性分布情况存在着差异，因此STR的群体遗传学资料是相当重要的，有必要对中国不同民族和地区的群体STR多态性分布进行调查。国内外许多遗传学家，尤其是法医工作者在这方面做了大量的工作。这些资料也为法医学个体识别及亲子鉴定提供了概率计算依据。

⑵Y染色体STR基因座

Y染色体STR自文献报道以来，证明是法医学分析和父权鉴定十分有用的标记。它扩增片段短、多态信息含量高，也为法医学及群体遗传学研究提供了新的工具。迄今为止，约有250多个Y-STR基因座被发现 .目前，常用的Y-STR有DYS19，DYS385a,b，DYS389Ⅰ， DYS389Ⅱ， DYS390，DYS391，DYS392，DYS393，DYS437，DYS438和DYS439等。

Y染色体是男性所独有染色体，人类Y染色体约7Mbp。

与常染色体相比较，Y染色体具有独特性：

①单倍体，除拟常染色体区域外，其余大部分在减数分裂时不与X染色体发生重组；

②呈稳定的父系遗传，父亲的Y染色体毫无变化的传递给儿子。

在异染色质区的绝大部分的Y染色体重复序列DNA,在减数分裂过程中不与X染色体发生同源重组，其DNA序列的改变只是由突变而引起。这部分构成人类Y染色体特异的DNA多态性。Y-DNA多态性分析越来越受到重视，特别是最近发现的Y染色体特异性微卫星。因其等位基因多、遗传信息丰富的优点，更是受到了格外的关注。作为母系遗传mtDNA多态性的补充，父系Y-STR多态性分析为阐明现代人类群体间的关系及人类进化的时间和地点提供了新的分子生物学证据。与此同时，Y-STR多态性分析在个体识别中的运用价值亦开始受到重视。

Y染色体上基因座呈连锁遗传，Y染色体遗传标记具有呈单倍型遗传的特征。由于缺乏重组，Y-STR多态性相对缺乏，单个基因座提供的信息有限。为充分利用Y-STR多态信息，建立合适的单倍型是必要的。对Y-STR基因座组成的单倍型进行群体遗传学调查表明，Y-STR单倍型比等位基因频率更具有价值。特别是研究人类起源、进化、迁移及部族关系等方面，同样具有重大的应用价值。

Y-STR可对混有女性检材的男性检材进行精确检验，而不受女性DNA的影响。有些强奸案中的混合斑中检不出精子，利用Y-STR检验技术则可对混合斑精液中的上皮细胞和白细胞进行分型。利用Y染色体特异的STR基因座在无法获得在逃嫌疑人检材的情况下，只要有其父亲、兄弟、儿子或亲侄儿等的样本，即可实现与现场检材的对比。Y-STR基因座的父系遗传特点，同一父亲下所有男性个体的分型一致，故也可应用于只有父亲的父权鉴定，同父异母的兄弟鉴定。无父母情况下的亲缘关系鉴定。

⑶X染色体STR基因座

X染色体为性染色体，男性为XY，女性为XX。男性的X染色体来自母亲，与父亲无关，并将X染色体传递给女儿。女性的二个X一个来自父亲，一个来自母亲。父亲的X只传递给女儿；而母亲的2个X染色体中任1个均有可能或传递给儿子或传递给女儿。所以，X染色体的遗传既不同于常染色体，也不同于Y染色体。性染色体上等位基因的传递均表现为性连锁（sex-linked）遗传特征，而其中X染色体的等位基因传递，表现为交叉传递。X染色体的STR基因座，正常男性个体只有一个等位基因一条带，女性有二个等位基因，如二个等位基因不相同，表现为二条带，如二个等位基因相同则表现为一条带。

X染色体的STR，由于其独特的遗传方式，在解决某些特殊的案例中，如缺乏双亲认定姐妹亲缘关系的案件中具有一些常染色体遗传标记所无法比拟的优点，已引起法医DNA工作者的注意，并已经发掘出有法医学应用价值的X染色体STR（X-STR）几十个，如：HumAR、HPRTB、DXS6807、DXS101、DXS6789、DXS7424、DXS6804、DXS6799、DXS7132等。

X-STR为性连锁遗传，以单倍体形式给子代。因此，X-STR在应用上增加了特点，尤其是单亲父女关系的亲权鉴定。对于父女关系的单亲，既不能应用父系遗传的Y染色体基因座，也不能应用母系遗传的线粒体DNA分析，但可以用X-STR基因座分析父女单亲关系，父亲的X染色体必遗传给其女儿。如果女儿的X-STR基因座的等位基因与被假定的父亲不同，可以直接排除其父女关系，如果相同，则不能排除其父女关系，可以结合常染色体STR确定是否存在父女关系。对于同父异母姐妹血缘关系鉴定的案件，若没有双亲参与检验，常染色体STR无法确定姐妹关系，线粒体的多态性标记也不能用来确定同父所生的关系。如检测X-STR，若两人间没有相同的单倍型，如果无突变，就可以做出两人不是同父所生的结论。

X-STR在法医学应用的另一方面是个体识别。除具有与常染色体STR功能外，对于男性除精液（斑）外的体液（斑痕）或组织样品，单一男性样品DNA只有一个X染色体DNA，X-STR基因座只有一个等位基因。如果出现二个或二个以上等位基因则表明被检验样品混有其他个体DNA，为混合样品。即使是同胞个体间DNA混合样品，也有可能被检出。