植物组织中ATP酶活力的测定

了解ATP酶在植物代谢过程中的作用，掌握ATP酶活力测定的原理和方法。

ATP酶（adenosine triphosphatase）可催化ATP水解生成ADP及无机磷，这一反应放出大量能量，以供生物体进行各需能生命过程。它存在于生物细胞的多个部位，如细胞质膜上、叶绿体类囊体膜上，对整个生命的维持有着重要的作用。在生物学研究中，常通过测定酶促反应释放的无机磷量或ATP的减少量以及pH变化等来测定ATP酶的活力。

本实验通过测酶促反应过程中无机磷的释放量来测定叶绿体偶联因子ATPase的活力。偶联因子是分布在叶绿体类囊体膜表面的一种复合蛋白，它在光合作用能量转换反应中起重要作用。

在正常情况下，膜上的偶联因子催化光合磷酸化反应（ATP合成）的速率很高，而水解ATP的活力是十分低的，但用二硫苏糖醇（DTT）、胰蛋白酶或较高温度等激活后。它水解ATP的活力可大大增加。因此，偶联因子的测定常用激活后的ATPase水解ATP的活力来表示。

材料：新鲜菠菜叶片。

试剂：

①1 mol · L^-1 Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）：称 57 g Tris 溶于 400 mL 蒸馏中，用浓盐酸调至pH 8.0,再加蒸搐水至500 mL。

②5 mol・L^-1硫酸溶液：取27. 8 mL（相对密度1.84）浓硫酸，慢慢加入70 mL蒸馏水中，冷却后定容至100 mL。

③10% 硫酸钥酸铉溶液：称10 g钥酸镂溶于100 mL 5 mol・L^-1硫酸中。

④硫酸亚铁-钥酸铉试剂：称5 g硫酸 亚铁，加入10 mL硫酸钥酸铉，再加蒸馅水稀释到70 mL，直至溶解为止（用前临时配制）。

⑤STN缓冲液,将0.05 mol · L^-1 Tris-HCl pH 7.8缓冲液（内含0.4 mol・蔗糖溶液、 0.01 mol · L^-1 NaCl溶液）放入冰箱中预冷。

器材：分光光度计，水浴锅，照光设备（光源50 000 lx）,台式离心机。

植物组织中ATP酶活力的测定的基本过程可分为如下几步：

（一）叶绿体制备

1. 取准备好的菠菜叶5 g置于研钵或组织捣碎机杯中，加入20 mL 0°C下预冷的STN缓冲 液，很快研磨或捣碎（0.5 min完成），做成匀浆，以4层纱布过滤去粗渣，滤液于0~2°C下， 200 g离心约1 min,去细胞碎片，将上清液再于1500 g离心5~7 min,取沉淀悬浮于少量 STN（pH 7.8）中，使叶绿素含量在0.5 mg · mL^-1左右。

（二）ATP酶的激活

1. MgH-ATP酶激活液及反应液配制（表37-1）。

2. 激活过程：取已制备好的叶绿体悬浮液1 mL（叶绿素含量约为1 mg · mL-1）,加入 1 mL激活液，于室温在白炽光50000 lx下进行光激活6 min。

3. 反应过程：取3支试管，分别加入上述激活后的叶绿体悬浮液各 5 mL，再加入 0.5 mL的反应液，取两支管置37 °C水浴中（另一支管置冰浴中作空白用）保温10 min,各加 入0.1 mL 20% 的三氯乙酸停止反应。用台式离心机离心后各取上清液0.3~0.5 mL（取样量按活力大小而改变）供测定ATP水解的无机磷用。

（三） 无机磷的测定

取反应后经离心的上清液0.5 mL加入2. 5 mL蒸馏水，摇匀后加入2 mL硫酸亚铁钥酸铉试剂，于室温放置1 min后显色即稳定，置分光光度计上用660 nm比色测定吸光度。

（四） 结果计算

ATP酶活力的计算，按表37-2配制不同浓度的无机磷标准液，于分光光度计上用 660 nm比色测定吸光度。以无机磷浓度作横坐标，所测得的吸光度作纵坐标绘制标准曲线， 按下式计算ATP酶活力：

式中s一从标准曲线上查得的无机磷含量，μ mol；

Vr—反应体积，mL；

W一叶绿素的质量，mg；

Vs —测定时取用体积，mL；

t—反应时间，min。

1 .制备叶绿体悬液时，加入悬浮介质速度要缓慢，以便保持叶绿体的完整度。

2. ATP酶激活的条件。