纤维素酶活力的测定

材料: 新华定量滤纸，脱脂棉，峻甲基纤维素钠，水杨酸昔。

器材：可见分光光度计，恒温水浴锅，沸水浴锅，电炉，剪刀，分析天平，恒温干燥箱，冰 箱, 试管架，胶头滴管，20 mL 具塞刻度试管，0.5 mL、2 mL 移液管或加液器，100 mL、 1 000 mL 容量瓶，50 mL、100 mL、500 mL 量筒・ 100 mL、500 mL、1 000 mL 烧杯。

试剂：

（1） 浓度为 1 mg - mL-1 的葡萄糖标准液：将葡萄糖在恒温干燥箱中 105°C 下干燥至恒 重，准确称取 100 mg 于 100 mL 小烧杯中，用少量蒸儒水溶解后，移入 100 mL 容量瓶中用蒸 偕水定容至 100 mL, 充分混匀。于 4°C 冰箱中保存（可用 12〜15 d）。

（2） 3,5-Z1 硝基水杨酸（DNS）溶液：准确称取 DNS 6.3 g 于 500 mL 大烧杯中，用少量蒸 憶水溶解后，加入 2 mol - L_1NaOH 溶液 262 mL, 再加到 500 mL 含有 185 g 酒石酸钾钠（C₄ HtO₆KNa - 4 H₂O, 相对密度为 282.22）的热水溶液中，再加 5 g 结晶酚（C₆ H₅OH, 相对 密度为 94. 11）和 5 g 无水亚硫酸钠（Na₂SO₃, 相对密度为 126.04）, 搅拌溶解，冷却后移入 1 000 mL 容量瓶中用蒸個水定容至 1 000 mL, 充分混匀。贮于棕色瓶中，室温放置 1 周后 使用。

（3） 0. 05 mol・L_1 pH 4. 5 的柠檬酸缓冲液：

A 液（0.1 mol・L"1 柠檬酸溶液）：准确称取 C₆ H₈O₇ -氏 0（相对密度为 210. 14）21.014 g 于 500 mL 大烧杯中，用少量蒸憎水溶解后，移入 1 000 mL 容量瓶中用蒸偕水定容 至 1 000 mL, 充分混匀。4°C 冰箱中保存备用。

B 液（0.1 mol - L"1 柠檬酸钠溶液）：准确称取 Na₃C₆ H₅O₇ - 2 H₂O（相对密度为 294. 12）29.412 g 于 500 mL 大烧杯中，用少量蒸儒水溶解后，移入 1 000 mL 容量瓶中, 然后 用蒸個水定容至 1 000 mL, 充分混匀。于 4°C 冰箱中保存备用。取上述 A 液 27.12 mL,B 液 22. 88 mL, 充分混匀后移入 100 mL 容量瓶中用蒸儒水定容 至 100 mL, 充分混匀，即为 0. 05 mol・L^pH 4.5 的柠檬酸缓冲液。于 4 笆冰箱中保存备 用，用于测定滤纸酶活力。

(4)0. 05 mol - L 'pH 5. 0 的柠檬酸缓冲液：取上述 A 液 20. 5 mL,B 液 29.5 mL, 充分 混匀后移入 100 mL 容量瓶中用蒸憎水定容至 100 m»充分混匀。即为 0.05 mol - L 1 pH 5.0 的柠檬酸缓冲液。于 4°C 冰箱中保存备用，用于测定 G 酶活力。

(5)0.51% 狡甲基纤维素钠 (CMC) 溶液：精确称取 0.51 g CMC 于 100 mL 小烧杯中，加 入适量 0.05 mol - L lpH 5.0 的柠檬酸缓冲液，加热溶解后移入 100 mL 容量瓶中并用 0. 05 mol・L~l pH 5.0 的柠檬酸缓冲液定容至 100 mL, 用前充分摇匀。于 4°C 冰箱中保存 备用，用于测定 Cx 酶活力。

(6)0. 5% 水杨酸昔溶液: 准确称取 0.5 g 水杨酸昔于 100 mL 小烧杯中. 用少量 0. 05 mol - L'1 pH 4.5 的柠檬酸缓冲液溶解后，移入 100 mL 容量瓶中并用 0. 05 mol - L'1 pH 4.5 的柠檬 酸缓冲液定容至 100 mL, 充分混匀。于 4°C 冰箱中保存备用，用于测定所葡萄糖昔酶活力。

(7) 纤维素酶液的配制：准确称取纤维素酶制剂 500 mg 于 100 mL 小烧杯中，用少量蒸 馋水溶解后•移入 100 mL 容量瓶中, 用蒸懈水定容至 100 mL, 此酶液的浓度为 5 mg - mL — ', 于 4°C 冰箱中保存备用。

纤维素酶活力的测定的基本过程可分为如下几步：

1. 葡萄糖标准曲线的制作：取 8 支洗净烘干的 20 mL 具塞刻度试管，编号后按表 50-1 加 入标准葡萄糖溶液和蒸馅水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管 中加入 1.5 mL DNS 溶液, 摇匀后沸水浴 5 min, 取出并冷却后用蒸馅水定容至 20 mL, 充分 混匀。在 540 nm 波长下，以 1 号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其他各管溶液的光密 度值并记录结果。以葡萄糖含量 (mg) 为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，在坐标纸上绘 制出葡萄糖标准曲线。

表 50-1 葡萄糖标准曲线制作加样表

				管号
试剂	1	2	3	4	5	6	7	8
葡萄糖标液/mL	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	1.4
蒸搐水/ mL	2.0	1.8	1.6	1.4	1.2	1.0	0.8	0.6
葡萄糖含量/mg	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	1.4

2. 滤纸酶活力的测定：取 4 支洗净烘干的 20 mL 具塞刻度试管，编号后各加入 0.5 mL 酶液和 1.5 mL 0. 05 mol - L !pH 4.5 的柠檬酸缓冲液，向 1 号试管中加入 1.5 mL DNS 溶 液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将 4 支试管同时在 50°C 水浴中预热 5〜 10 min, 再各加入滤纸条 50 mg(新华定量滤纸，约 1 cm X 6 cm),50°C 水浴中保温 1 h 后取 出立即向 2、3、4 号试管中各加入 1. 5 mL DNS 溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴 5 min, 取出冷却后用蒸儒水定容至 20 mL, 充分混匀。以 1 号试管溶液为空白对照调零点，在

540 nm 波长下测定 2、3、4 号试管液的光密度值并记录结果。

根据 3 个重复光密度的平均值，在标准曲线上査出对应的葡萄糖含量，按下式计算出滤 纸酶活力（U - g_1 - min-1）. 在上述条件下，每小时由底物生成 1 卩 mol 葡萄糖所需的酶量 定义为一个酶活力单位（U）。

3.G 酶活力的测定：将 5 mg - mL"1 的原酶液稀释 10〜15 倍后用于测定 G 酶活力，以 脱脂棉为底物。

取 4 支洗净烘干的 20 mL 具塞刻度试管，编号后各加入 50 mg 脱脂棉，加入 1.5 mL 0. 05 mol - IZ1 pH 5.0 的柠檬酸缓冲液，并向 1 号试管中加入 1. 5 mL DNS 溶液以钝化酶活 性，作为空白对照，比色时调零用。将 4 支试管同时在 45°C 水浴中预热 5〜10 min, 再各加入 适当稀释后的酶液 0.5 mL,45°C 水浴中保温 24 ho 取出后立即向 2、3、4 号试管中各加入 1.5 mL DNS 溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴 5 min, 取出冷却后用蒸憶水定容至 20 mL, 充分混匀。以 1 号试管溶液为空白对照调零点，在 540 nm 波长下测定 2、3、4 号试管 液的光密度值并记录结果。

根据 3 个重复光密度的平均值，在标准曲线上査出对应的葡萄糖含量，按下式计算出 0 酶活力（U • g 1 • min-^o 在上述条件下反应 24 h, 由底物生成 1 Mmol 葡萄糖所需的酶量 定义为一个酶活力单位（U）。

4.Cx 酶活力的测定：将 5 mg - mL-1 的原酶液稀释 5 倍后用于测定 Cx 酶活力，以 CMC 为底物。

取 4 支洗净烘干的 20 mL 具塞刻度试管，编号后各加入 1.5 mL 0.51% CMC 柠檬酸缓 冲液，并向 1 号试管中加入 1.5 mL DNS 溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。 将 4 支试管同时在 50°C 水浴中预热 5〜10 min, 再各加入稀释 5 倍后的酶液 0.5 mL,50°C 水 浴中保温 30 min 后取岀，立即向 2.3.4 号试管中各加入 1.5 mL DNS 溶液以终止酶反应，充 分摇匀后沸水浴 5 min, 取岀并冷却后用蒸憶水定容至 20 mL, 充分混匀。以 1 号试管溶液为 空白对照调零点，在 540 nm 波长下测定 2、3、4 号试管液的光密度值并记录结果。

根据 3 个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出 Cx 酶活力（U - gf・mirT】）。在上述条件下，每小时由底物生成 1 卩 mol 葡萄糖所需的酶量定 义为一个酶活力单位（U）。

5.0-葡萄糖昔酶活力的测定：取 4 支洗净烘干的 20 mL 刻度试管, 编号后各加入 1.5 mL 0. 5% 水杨酸昔柠檬酸缓冲液，并向 1 号试管中加入 1.5 mL DNS 溶液以钝化酶活性，作为空 白对照，比色时调零用。将 4 支试管同时在 50°C 水浴中预热 5〜10 min, 再各加入酶液 0.5 mL,50°C 水浴中保温 30 min, 取岀后立即向 2、3、4 号试管中各加入 1.5 mL DNS 溶液以 终止酶反应，充分摇匀后沸水浴 5 min, 取出冷却后用蒸僧水定容至 20 mL, 充分混匀。以 1 号试管溶液为空白对照调零点，在 540 nm 波长下测定 2、3、4 号试管液的光密度值并记录 结果。

根据 3 个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出/?- 葡萄糖昔酶活力（U - gT - min^）。在上述条件下，每小时由底物生成 1 Mmol 葡萄糖所需 的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

6 . 结果计算：

（1）葡萄糖标准曲线的制作（表 50-2）：

表 50-2 标准曲线制定加样表

项目				管号
	1	2	3	4	5	6	7	8
葡萄糖含量/mg	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	1.4
光密度（ODWnni）	0

根据表中数值，以葡萄糖含量（mg）为横坐标, 以对应的光密度值为纵坐标，在坐标纸上 绘制出葡萄糖标准曲线。

（2）滤纸酶活力的测定结果计算，填入表 50-3：

表 50・3 滤纸醯活力的测定数据表

项目		管号			三管平均值
	1	2	3	4
光密度（OD 汹响）	0
葡萄糖含量/mg	0

滤纸酶活力（U - gf・min-l）=

葡萄糖含量（mg）X 酶液定容总体积（mL）X 5.56 /mol

反应液中酶液加入量（mL）X 样品重（g）X 时间（h）

葡萄糖含量（mg）X 100 mL X 5. 56 ptmol

0. 5 mL X 0. 5 gX 1 h

式中：5. 56—1 mg 葡萄糖的物质的量（1 000/180 = 5. 56）屮 mol。

（3）C】酶活力的测定结果计算，填入表 50-4；

表 50-4 G 酶活力的测定数据表

项目			管号		三管平均值
	1	2	3	4
光密度 (OD5Wum)	0
葡萄糖含量/mg	0

G 酶活力（U - g 1 - min~1）=

葡萄糖含量（mg）X 酶液定容总体积（mL）X 稀释倍数 X 5.56 卩 mol X 24 h -反应液中酶液加入量（mL）X 样品重（g）X 时间（h）

—葡萄糖含量（mg）X 100 mL X 稀释倍数 X 5. 56 卩 mol X 24 h

0. 5 mL X 0. 5 g X 24 h

式中：24-酶活力定义中的 24 h。

（4）Cx 酶活力的测定结果计算，填入表 50-5：

表 50-5G 酶活力的测定数据表

项目		管号			三管平均值
	1	2	3	4
光密度（OD540nm）	0
葡萄糖含量/mg	0

Cx 酶活力（u・ gf - min^）=

葡萄糖含量（mg）X 酶液定容总体积（mL）X 稀释倍数 X 5. 56 /imol

反应液中酶液加入量（mL）X 样品重（g）X 时间（h）

—葡萄糖含量（mg）X 100 mLX 5（倍）乂 5. 56 〃mol

0. 5 mL X 0. 5 g X 0. 5 h

（5）0-葡萄糖昔酶活力的测定结果计算，填入表 50-6：

表 50-6 。-葡萄糖吾酶活力的测定数据表

项目		管号			三管平均值
	1	2	3	4
光密度 (OD5.,0nra)	0
葡萄糖含量/mg	0

母葡萄糖昔酶活力（U - g [= 0. 5 mL X 0. 5 gX 0. 5 h

1.DNS 溶液配制时，将含 DNS 的 NaOH 溶液加到含酒石酸钾钠的热水溶液中，一定要 慢倒，边倒边搅拌，以防被烫。

2.纤维素酶液的浓度可根据不同酶制剂的活力而相应调整。如果酶活力高, 酶浓度可小 些；反之，酶活力低时，酶浓度则大些。

3 . 测定酶活时，滤纸条和脱脂棉等底物一定要充分浸入反应液中。