纤维素酶活力的测定

一、目的
学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。

二、原理
纤维素酶是一种多组分酶，包括C ₁ 酶、C _X 酶和¦Â-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，C _X 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，¦Â-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm 波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。

三、实验材料、主要 仪器 和试剂
1．实验材料
（1）纤维素酶制剂 500mg
（2）新华定量滤纸 50mg / 份 × 4
（3）脱脂棉花 50mg / 份 × 4
（4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg
（5）水杨酸苷 500mg
2．主要 仪器
（1）722 型或其他型号的可见分光光度计
（2）恒温水浴2 台
（3）沸水浴锅
（4）电炉子
（5）剪刀
（6）万分之一分析天平
（7）恒温干燥箱
（8）冰箱
（9）试管架
（10）胶头滴管
（11）具塞刻度试管 20mL×24
（12）移液管或加液器 0.5 mL×3；2mL×7
（13）容量瓶 100 mL×6；1000 mL×3
（14）量筒 50 mL×2；100 mL×1；500 mL×1
（15）烧杯 100 mL×6；500mL×3；1 000 mL×1
3． 试剂 （均为分析纯）
（1）浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液
将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存（可用12～15 天）。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液
准确称取DNS 6.3g 于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液262mL，再加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠（C ₄ H ₄ O ₆ KNa · 4H ₂ O，MW=282.22）的热水溶液中，再加5g结晶酚（C ₆ H ₅ OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na ₂ SO ₃ ，MW=126.04），搅拌溶解，冷却后移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。
（3）0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液A 液（0.1 mol/L 柠檬酸溶液）：准确称取C ₆ H ₈ O ₇ · H ₂ O（MW=210.14）21.014g 于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。