植物根系活力的测定

植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的营养状况及产量水平。本实验练习测定根系活力的方法，为植物营养研究提供依据。

一、原理

氯化三苯基四氮唑（ TTC ）是标准氧化电位为 80 mV 的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲 （ TTF ），如下式：

 

 

 

生成的三苯甲 （ TTF ）比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以 TTC 被广泛用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的 TTC 还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以 TTC 还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。

二、实验材料、试剂与仪器设备

（一）实验材料

水培或砂培小麦、玉米等植物根系。

（二）试剂

1. 乙酸乙酯（分析纯）。

2. 次硫酸钠（ Na 2 S 2 O 4 ，分析纯），粉末。

3. 1 ％ TTC 溶液：准确称取 TTC 1.0 g ，溶于少量水中，定容到 100 mL 。用时稀释至需要的浓度。

4. 磷酸缓冲液（ 1/15 mol/L ， pH7.0 ）。

5. 1 mol/L 硫酸：用量筒取比重 1.84 的浓硫酸 55 mL ，边搅拌边加入盛有 500 mL 蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至 1000 mL 。

6. 0.4 mol/L 琥珀酸：称取琥珀酸 4.72 g ，溶于水中，定容至 100 mL 即成。

（三）仪器设备

小烧杯 3 个，研钵 1 个，移液管： 0.5 mL 1 支、 10 mL 1 支、 5 mL 3 支，刻度试管 6 支，分光光度计，分析天平（感量 0.1 mg ），电子顶载天平（感量 0.1 g ），温箱，试管架，药勺，石英砂适量，滤纸。

三、实验步骤

1. 定性测定

（ 1 ）配制反应液 把 1 ％ TTC 溶液、 0.4 mol ／ L 的琥珀酸和磷酸缓冲液按 1:5:4 比例混合。

（ 2 ）把根仔细洗净，把地上部分从茎基部切除。将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置 37 ℃左右暗处放 1 ～ 3 h ，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。

2. 定量测定

（ 1 ） TTC 标准曲线的制作 取 0.4 ％ TTC 溶液 0.2 mL 放入大试管中，加 9.8 mL 乙酸乙酯，再加少许 Na 2 S 2 O 4 粉末摇匀，则立即产生红色的 TTF 。此溶液浓度为每毫升含有 TTF 80 μg 。分别取此溶液 0.25 mL 、 0.50 mL 、 1.00 mL 、 1.50 mL 、 2.00 mL 置 10 mL 刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含 TTF 20 μg 、 40 μg 、 80 μg 、 120 μg 、 160 μg 的系列标准溶液，以乙酸乙酯作参比，在 485 nm 波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

（ 2 ）称取根尖样品 0.5 g ，放入小烧杯中，加入 0.4 ％ TTC 溶液和磷酸缓冲液（ pH7.0 ）各 5 mL ，使根充分浸没在溶液内，在 37 ℃下暗保温 1 ～ 2 h ，此后立即加入 1 mol/L 硫酸 2 mL ，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品， 37 ℃下暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上）。

（ 3 ）把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯 3 ～ 4 mL ，充分研磨，以提出 TTF 。把红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤 2 ～ 3 次，皆移入刻度试管，最后加乙酸乙酯使总量为 10 mL ，用分光光度计在波长 485 nm 下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出 TTC 还原量。

四、结果计算

根系活力 = [mg TTF/ （ g ・ h ） ]

 

式中： C ――四氮唑还原量， μg 。

W ――根重， g 。

h ――时间， h 。

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