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植物根系活力的测定

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植物根系是活跃的吸收器官和合成器官,根的生长情况和活力水平直接影响地上部的营养状况及产量水平。本实验练习测定根系活力的方法,为植物营养研究提供依据。

一、原理

氯化三苯基四氮唑( TTC )是标准氧化电位为 80 mV 的氧化还原色素,溶于水中成为无色溶液,但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲 ( TTF ),如下式:

 

 

 

生成的三苯甲 ( TTF )比较稳定,不会被空气中的氧自动氧化,所以 TTC 被广泛用作酶试验的氢受体,植物根系中脱氢酶所引起的 TTC 还原,可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强,而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以 TTC 还原量能表示脱氢酶活性,并作为根系活力的指标。

二、实验材料、试剂与仪器设备

(一)实验材料

水培或砂培小麦、玉米等植物根系。

(二)试剂

1. 乙酸乙酯(分析纯)。

2. 次硫酸钠( Na 2 S 2 O 4 ,分析纯),粉末。

3. 1 % TTC 溶液:准确称取 TTC 1.0 g ,溶于少量水中,定容到 100 mL 。用时稀释至需要的浓度。

4. 磷酸缓冲液( 1/15 mol/L , pH7.0 )。

5. 1 mol/L 硫酸:用量筒取比重 1.84 的浓硫酸 55 mL ,边搅拌边加入盛有 500 mL 蒸馏水的烧杯中,冷却后稀释至 1000 mL 。

6. 0.4 mol/L 琥珀酸:称取琥珀酸 4.72 g ,溶于水中,定容至 100 mL 即成。

(三)仪器设备

小烧杯 3 个,研钵 1 个,移液管: 0.5 mL 1 支、 10 mL 1 支、 5 mL 3 支,刻度试管 6 支,分光光度计,分析天平(感量 0.1 mg ),电子顶载天平(感量 0.1 g ),温箱,试管架,药勺,石英砂适量,滤纸。

三、实验步骤

1. 定性测定

( 1 )配制反应液 把 1 % TTC 溶液、 0.4 mol / L 的琥珀酸和磷酸缓冲液按 1:5:4 比例混合。

( 2 )把根仔细洗净,把地上部分从茎基部切除。将根放入三角瓶中,倒入反应液,以浸没根为度,置 37 ℃左右暗处放 1 ~ 3 h ,以观察着色情况,新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色,表明该处有脱氢酶存在。

2. 定量测定

( 1 ) TTC 标准曲线的制作 取 0.4 % TTC 溶液 0.2 mL 放入大试管中,加 9.8 mL 乙酸乙酯,再加少许 Na 2 S 2 O 4 粉末摇匀,则立即产生红色的 TTF 。此溶液浓度为每毫升含有 TTF 80 μg 。分别取此溶液 0.25 mL 、 0.50 mL 、 1.00 mL 、 1.50 mL 、 2.00 mL 置 10 mL 刻度试管中,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到含 TTF 20 μg 、 40 μg 、 80 μg 、 120 μg 、 160 μg 的系列标准溶液,以乙酸乙酯作参比,在 485 nm 波长下测定吸光度,绘制标准曲线。

( 2 )称取根尖样品 0.5 g ,放入小烧杯中,加入 0.4 % TTC 溶液和磷酸缓冲液( pH7.0 )各 5 mL ,使根充分浸没在溶液内,在 37 ℃下暗保温 1 ~ 2 h ,此后立即加入 1 mol/L 硫酸 2 mL ,以停止反应。(与此同时做一空白实验,先加硫酸,再加根样品, 37 ℃下暗保温后不加硫酸,其溶液浓度、操作步骤同上)。

( 3 )把根取出,用滤纸吸干水分,放入研钵中,加乙酸乙酯 3 ~ 4 mL ,充分研磨,以提出 TTF 。把红色提取液移入刻度试管,并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤 2 ~ 3 次,皆移入刻度试管,最后加乙酸乙酯使总量为 10 mL ,用分光光度计在波长 485 nm 下比色,以空白试验作参比测出吸光度,查标准曲线,即可求出 TTC 还原量。

四、结果计算

根系活力 = [mg TTF/ ( g ・ h ) ]

 

式中: C ――四氮唑还原量, μg 。

W ――根重, g 。

h ――时间, h 。

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