纤维素降解菌外膜蛋白的提取方法？

我是想让细菌活着从纤维素上玻璃下来呢

培养2L 细胞至OD600=0.8-1.0，7000rpm，离心10min收集细胞，用20ml 冰冷的 20% 蔗糖溶液（10mM pH 8.0的Tris溶液，添加 50ug/ml 的DNase I）重悬细胞，室温下孵育15 min。法国压力细胞压壶用15000psi压碎细胞两次，like将压碎的细胞转移到冰上抑制蛋白酶的活性。3000rpm，4℃，10 min 离心去除细胞碎片。对于外膜和内膜的粗分离，采用两步梯度法：SW41 转子 SW27/8转子，4 ml 70% 蔗糖 14 ml 70%蔗糖，4 ml 60%蔗糖 14 ml 60%蔗糖，4 ml 样品（20% 蔗糖） 9 ml 样品（20% 蔗糖），调节70%的体积填满离心管 可以用50%蔗糖代替60%蔗糖提高外膜的产率， SW 41转子中 4 ℃，39 000 rpm 离心 4h或过夜，或者SW27/8转子中4℃，23000rpm离心过夜。两步梯度离心后应该会出现两层。上层应该为微红色，下层为白色。外膜在下层中。外膜应该在60%和70%连接处，内膜应该在20%和60%连接处。可以用烧红的针头在管底开一个洞，让蔗糖溶液流掉，只收集膜的部分。用管底开口的方法分开收集不同的膜组分。将收集的膜放在60Ti的管中，加入至少两倍体积的超纯水稀释蔗糖浓度低于20%。47000rpm离心 1小时。注射器重悬大约1ml的样品。

A． 传统的蔗糖梯度离心（SGU）：传统的蔗糖梯度离心法自上世纪 60-70 年代开发，至今仍被许多实验室用于质膜蛋白提取，蔗糖梯度离心可以将细胞蛋白分离成不同的组分和高度浓缩的膜蛋白。这种传统的方法需要大量的起始材料，操作过程复杂耗时。

B． 双水相亲和性分离：此方法的特点是大多数的亲水性聚合物对在水溶液中是不相容的，产生两个共存相，相互平衡。利用这个性质可以分离许多生物分子包括膜蛋白。该方法相对简单，快速，但是所需的起始细胞数相对较高，且产量相对较低。

C． 离心管柱法：使用离心管柱分离技术起始材料仅需 undefined107 个细胞，即可将细胞/组织分离为细胞浆，细胞核，细胞器和质膜组分。离心管柱带有特定孔径和表面性质，当细胞通过离心管柱，细胞膜被破裂分离出完整的细胞核，随后通过差速离心和密度离心分离出质膜蛋白，无需使用超高速离心。可以应用于 SDS-PAGE、immunoblottings、ELISA、IP、Co-IP、MS、2-D、酶活性检测等其他应用。