重叠延伸 PCR 构建定点突变序列

重叠延伸 PCR 构建定点突变序列，是指在重叠延伸 PCR 中，两个重叠的 DNA 片段是分别从两个独立的 PCR 扩增反应得到的。混合两次 PCR 的产物，由于两个突变引物有重叠区，重叠片段之间退火、延伸成异源双链，加入外侧引物进行第三次 PCR，即可得到目标突变体。

重叠延伸 PCR 构建定点突变序列的基本原理在重叠延伸 PCR 中，两个重叠的 DNA 片段是分别从两个独立的 PCR 扩增反应得到的。预设突变构建在重叠区域，存在于两个扩增片段中。

设计四种引物，用第一对引物扩增含有突变位点及其上游序列的 DNA 片段，第二对引物被用来扩增含突变位点及其下游序列的 DNA 片段，两个侧翼引物含野生型序列，两个突变引物含有希望引进的突变位点，如置换、插入或缺失。混合两次 PCR 的产物，由于两个突变引物有重叠区，重叠片段之间退火、延伸成异源双链，加入外侧引物进行第三次 PCR，即可得到目标突变体。图解示意。

器材：

① PCR 扩增仪

② 电泳仪

③ 水平电泳槽

试剂：

① 10 × PCR 缓冲液：内含 15 mmol/L MgCl₂、 500 mmol/L KCL、100 mmol/L Tris-HCl（pH8.3，25 ℃）；

② 10 × dNTP 混合物：内含 2 mmol/L dGTP、2 mmol/L dATP、2 mmol/L dCTP 和 2 mmol/L dTTP；

③ 2 种寡核苷酸引物（10 mol/L）；

④ 模板 DNA；

⑤ 热稳定 DNA 聚合酶；

⑥ 凝胶：含 0.5 g/mL 溴化乙锭的 1% 琼脂糖凝胶。

重叠延伸 PCR 构建定点突变序列的基本过程可分为如下几步：

① 一支 PCR 反应管中混合以下试剂，组成 PCR 反应 1：10 × PCR 缓冲液 10 μl、10 × dNTP 混合物 10 μl、10 μmol/L 突变引物 b 1 μl、热稳定 DNA 聚合酶 1~2 U、10 μmol/L 上游外侧引物 a 1 μl、水加至 100 μl 模板 DNA 约 10 pg。

② 第二支 PCR 反应管中混合以下试剂，组成 PCR 反应 2：10 × PCR 缓冲液 10 μl、模板 DNA 约 10 pg、10 × dNTP 混合物 10 μl、热稳定 DNA 聚合酶 1~2 U、10 μmol/L 突变引物 c 1 μl、水加至 100 μl、10 μmol/L 下游外侧引物 d 1 μl。

③ PCR 扩增：94 ℃ 预变性 4 min；循环 25 次，每次 94 ℃ 变性 1 min，50 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，最后一次延伸 10 min（可根据引物序列和扩增片段长度调节退火温度和延伸时间等反应条件）。

④ 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 反应产物。

⑤ 纯化 PCR 产物（选做）。

⑥ 在第三支 PCR 反应管中混合以下组分，组成 PCR 反应 3：10 × PCR 缓冲液 10 μl、 PCR 反应 2 扩增产物 100 pg、10 × dNTP 混合物 10 μl、热稳定 DNA 聚合酶 1~2 U、PCR 反应 1 扩增产物 100 pg、水加至 100 μl。

⑦ 94 ℃ 变性 1 min，50 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 5 min（可视情况进行几个循环，退火温度和延伸时间根据重叠区序列和片段长度确定）。

⑧ 加入 10 μmol/L 上游外侧引物 a 1 μl、10 umol/L 下游外侧引物 d 1 μl，循环 25 次，每次 94 ℃ 变性 1 min，50 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，最后一次延伸 10 min（可根据引物序列和扩增片段长度调节退火温度和延伸时间等反应条件）。

⑨ 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 反应产物。

⑩ PCR 产物克隆，筛选含预期突变的重组子，序列分析确证扩增的 DNA 片段的全序列。