致突变 PCR
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简介
致突变 PCR，是基于 PCR 技术在 DNA 序列中引入碱基突变或序列的插入和缺失的方法。致突变 PCR 可分为 2 种类型：构建突变体库的随机错掺 PCR 和定点突变 PCR，其中构建定点突变序列的方法主要包括重叠延伸 PCR 构建定点突变序列、大引物 PCR 构建定点突变序列、重组 PCR 构建定点突变序列和环状质粒 PCR 构建定点突变序列四种类型。
原理
致突变 PCR 包括构建突变体库的随机错掺 PCR 和定点突变 PCR。
构建突变体库的随机错掺 PCR 的基本原理是热稳定 DNA 聚合酶在反应过程中可能掺入不忠实于模板 DNA 的碱基，对 DNA 模板进行随机错误拷贝。例如，通过限定一种核苷酸的量而促使聚合酶选择另外三种核苷酸或预先加入的次黄喋吟核苷酸，进而导致错误拷贝；还可以利用某些热稳定 DNA 聚合酶（如 DNA 聚合酶）的 3'→ 5'外切酶功能缺失或不健全的特点，釆用这类酶进行 PCR, 链延伸过程中加入的非配对碱基不能被及时纠正，不可避免地导致错误核苷酸的掺入，个别酶在特殊情况下还可能导致核苷酸的缺失或插入。图解示意【】。
定点突变 PCR 的基本原理是通过引物引入错配碱基，或者是插入或缺失一个甚至多个碱基，这种突变是靶 向的，突变发生在 DNA 模板上预先确定的位置，许多设计都采用这种定点突变的方法，根据需要的不同，在引物的 5』端引入错配碱基。
来源：丁香实验团队
操作方法
随机错误掺入 PCR 构建突变体库，是在 PCR 中通过 DNA 聚合酶进行不正确拷贝，在整个 DNA 序列中进行散在的随机突变，使每一个分子带有一个或数个突变。
重叠延伸 PCR 构建定点突变序列重叠延伸 PCR 构建定点突变序列，是指在重叠延伸 PCR 中，两个重叠的 DNA 片段是分别从两个独立的 PCR 扩增反应得到的。混合两次 PCR 的产物，由于两个突变引物有重叠区，重叠片段之间退火、延伸成异源双链，加入外侧引物进行第三次 PCR，即可得到目标突变体。
大引物 PCR 构建定点突变序列大引物 PCR 构建定点突变序列只需要一个诱变引物，是目前以 PCR 为基础的诱变方法中最简单和经济的。
重组 PCR重组 PCR 构建定点突变序列，是指 PCR 产生的同源 DNA 末端在大肠杆菌内通过体内重组使 DNA 连在一起。
环状质粒 PCR 构建定点突变序列环状质粒 PCR 构建定点突变序列，是指直接将全长双链质粒 DNA 以线性形式扩增，产生一种 DNA 双链上带缺口的突变质粒，该质粒经磷酸化后自身连接形成环状闭合质粒。
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