随机错误掺入 PCR 构建突变体库

随机错误掺入 PCR 构建突变体库，是在 PCR 中通过 DNA 聚合酶进行不正确拷贝，在整个 DNA 序列中进行散在的随机突变，使每一个分子带有一个或数个突变。

随机错误掺入 PCR 构建突变体库的基本原理是当 4 种核苷酸的任一种在 PCR 反应中是限量时，会发生碱基的错误掺入。进行 4 种 PCR 反应，每种耗尽不同的核苷酸，且含有高浓度的次黄票吟核苷酸 dITP，在缺乏正确核苷酸时，DNA 聚合酶经短暂停顿后，选择次黄嘌呤核苷酸或另外 3 种核苷酸的一种掺入到所缺乏核苷酸的位点上。由于所有 4 种碱基都能同次黄嘌呤配对，下一轮 PCR 循环中在错误掺入位点上发生突变的概率理论上可以达到 75%。
即便核苷酸的量是正常的，如果在 PCR 中使用不具有 3'—5『外切酶功能的 DNA 聚合酶，同样可以产生随机突变。在所有已经知道的 DNA 聚合酶中，Taq DNA 聚合酶产生的错误掺入率最高，每扩增一次，核苷酸错配率在 0.1X10-4〜2X10-4 之间，具体数字由反应条件决定。经过 20〜25 轮循环 PCR, 每个核苷酸产生的累积错误率约达 10-3。 一般来说，这样的错误掺入率对于构建一个具有不同序列的变异库仍然不够，特别是对于扩增目的片段小于 1000 个核苷酸的情况。导致不足的另一个原因是，Taq DNA 聚合酶在普通 PCR 条件下总是有比较大的定向错掺趋势，即 A-T 对变 GC 对的倾向。通过调整反应条件可以解决这一问题，如提高 MgCl2 浓度以稳定非互补的碱基对，加入 MnCl2 以降低聚合酶对模板的特异性，增加 dCTP 和 dTTP 的浓度以促进错误掺入，增加 Taq DNA 聚合酶以促进延伸链在碱基错配位置后得以继续，最终使每一个核苷酸的错误率达到大约 7X10-3, 而且这种错误率没有序列倾向性。图解示意【】。

器材：

PCR 扩增仪、电泳仪、水平电泳槽

试剂：

①10X 致突变 PCR 缓冲液：内含 70 mmol/L MgCl₂，500 mmol/L KC1, 100 mmol/L Tris- HC1（pH8.3, 25 °C）, 1 g/L 明胶。

②10XdNTP 混合物：内含 2 mmol/L dGTP, 2 mmol/L dATP, 10 mmol/L dCTP 和 10 mmol/L dTTPo

③5 mmol/L MnCl₂ 水溶液：不与 10X 致突变 PCR 缓冲液混合。

④2 种寡核苷酸引物（10mol/L）。

⑤模板 DNA（lOng/ptDo

⑥Tag DNA 聚合酶。

⑦凝胶：含 0.5 g/mL 溴化乙锭的 1% 琼脂糖凝胶。

①致突变 PCR 的条件决定了一部分引物不可避免地与靶目标序列结合产生一些短扩增产 物，根据这些产物的大小可以确定引物发生错误退火的位置，必要时重新设计引物。也可首先进 行非致突变 PCR, 将特异的引物结合位点引入到 DNA 末端，然后再用能与上述位点配对的引物 进行致突变 PCRO

②MnCL 不能直接配制在 PCR 缓冲液中，应配成储存液备用，在配制反应体系时加入 MnCL 溶液后要混匀，并加入 Tag DNA 聚合酶启动扩增反应，否则容易形成沉淀。

③致突变 PCR 循环不需进行预变性，循环结束后也不需要再延伸。

④可以根据模板和引物的序列对标准条件作出相应调整，但鉴于 Tag DNA 聚合酶对反应条 件相当敏感，调整时一定要综合考虑修改可能产生的各种结果。