随机引物PCR

随机引物 PCR

一． 实验原理

聚合酶链式反应（ Polymerase chain reaction ）简称 PCR ，它是一种 DNA 体外扩增技术。 1985 年美国的 Mullis 等人发明了 PCR 技术，在体外利用模板 DNA 、特定的寡聚核苷酸引物和 DNA 聚合酶，通过 DNA 变性、复性和延伸过程合成一条互补的 DNA 链。反复重复这一过程，模板 DNA 就可得到大量扩增。在 PCR 过程中， DNA 的延伸起初是用大肠杆菌的 DNA 聚合酶 I （ Klenow 片段）来完成的。

由于大肠杆菌的聚合酶不耐热，每次加热变性 DNA 后都要补加新的聚合酶。这不仅增加了实验成本，而且当同时扩增多个样品时极易出错。在耐热 DNA 聚合酶（ Taq 酶）发现后，才使 PCR 技术的广泛应用成为可能。特别是自动热循环仪（又叫 DNA 扩增仪）的发明，使 PCR 反应过程可以电脑控制，实现了自动化。 PCR 技术的发明虽然只有 10 多年的时间，但目前这一技术及其衍生的其他实验技术在生物学的许多领域已得到了广泛的应用。

随机引物 PCR （ Arbitrary - primer PCR ，缩写为 AP- PCR ）又称随机扩增多态性 DNA （ Random amplified polimophic DNA ，缩写为 RAPD ），是 Williams 和 Welsh 等 1990 年在 PCR 的基础上发展起来的一种实验技术。

在 RAPD 扩增中，仅用一个 8-10 碱基的寡核苷酸引物，引物的序列是随机的。 RAPD 反应的条件与普通 PCR 基本相同。但由于引物较短，一般退火所需温度较低。 RAPD 与普通 PCR 的另一个明显的不同是前者不需知道模板 DNA 的序列，扩增出来的片段也是非特异性的；而后者则必须知道待扩增目的片段的序列，根据这一序列设计一对相应的引物。

RAPD 技术一出现，便以它的简便、快捷和多态性捡出率高而引起科学工作者的极大兴趣。目前这一技术已被广泛用于遗传图谱构建、群体遗传结构分析、 DNA 指纹分析和基因定位等不同研究领域。

二． 实验步骤

（1） 在 0.5ml 无菌离心管中依次加入下列溶液（在超净台上操作），加入后轻轻混匀。

无菌水 13 μ l

10 ×扩增缓冲液 2.5 μ l

4dNTPs 溶液 1.5 μ l

引物 2.5 μ l

植物 DNA （ 5ng/ μ l ） 5 μ l

Taq DNA 聚合酶 0.5 μ l

总体积 25 μ l

（2） 加入 100 μ l 矿物油，遮盖反应混合液的表面。

（3） 将试管转入 DNA 扩增仪，按下列条件进行扩增循环（需预先调节），共进行 45 个循环：

变性 复性 聚合反应

94 ° C ， 1 分 35 ° C ， 1 分 72 ° C ， 2 分

（4） 循环完成后，在 72 ° C 再延伸 6 分钟。

（5） 将反应产物在 1.4% 琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察扩增的 DNA 条带。

三． 实验材料

1． 实验样品

玉米或小麦核 DNA （用 CTAB 法提取）

2． 化学试剂和溶液

（1） 4 种 dNTP 混合溶液，浓度各为 2 mmol/L

（2） Tag DNA 聚合酶（ 2units/ μ l ）

（3） 10 扩增缓冲液

500mmol/L KCl

100mmol/L Tris.HCl(pH8.3)

15mmol/L MgCl 2

(4) 矿物油

(5) 1.4% 琼脂糖凝胶（含溴化乙锭 0.5 μ g/ μ l ）

(6) 5 TBE 缓冲液

(7) 扩增引物（ 10 个碱基的寡核苷酸片段），浓度为 4 μ mol/L

(8) DNA 分子量标记：λ DNA(EcoRI/Hind Ⅲ双酶切 )

3． 仪器设备和消耗品

DNA 扩增仪，电泳仪，电泳槽，移液器，离心管和移液器吸头等。

四． 注意事项

（1） 溴化乙锭有致癌作用，操作时一定要戴手套。

（2） 同一 DNA 样品可用不同的随机引物进行扩增。

（3） DNA 摸板和镁离子的浓度可进行调整，以得到稳定的扩增效果。

（4） 所用离心管、吸头和溶液等都要严格灭菌，在超净台上操作，以防反应体系被外源 DNA 污染。

五． 思考题

１． Taq DNA 聚合酶有何特性使之可以用于聚合酶链式反应？

２． 根据自己的实验观察，你认为哪些事项是 PCR 操作成功的关键所在？