cDNA合成的随机引物法

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cDNA合成时，合成第一链目前主要有三种方法。而且每一种方法之间存在着差异性，这些相对的特异性使得所得到的cDNA的数量和种类有所不同。这篇文章为大家介绍随机引物法的优劣势和特性。

随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5"末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体 RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。

Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3"端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2%，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR 。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。

基因特异性引物(GSP)对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3"最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行RT-PCR ，需要设计多于一个反义引物，因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20μl的第一链合成反应体系中使用1pmol反义GSP。

提高逆转录 保温温度

为了充分利用GSP特异性的全部优点，应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性。比如，如果一个GSP退火温度为55℃，那么如果使用AMV或M-MLV在低严谨性的37℃进行逆转录，GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而SuperScripⅡ和ThermoScript可以在50℃或更高进行反应，(表2)这就会消除较低温度时产生的非特异性产物(图10)。为获得最大的特异性，可以将RNA/引物混合物直接从65℃变性温度转移到逆转录保温温度，并加入预热的2×反应混合液(cDNA合成热启动)。这有助于防止低温时分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR 所需的多种温度转换。

使用ThermoScript™和设计用来同人DNA聚合酶εmRNA退火的GSP，由1μg Hela RNA合成cDNA。Thermoscript加入到预热的反应混合液中，使用Platinum Taq DNA聚合酶对1/10的cDNA进行35个循环的PCR。

减少基因组DNA污染

RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法，如Trizol Reagent，会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。为了避免产生于基因组DNA的产物，可以在逆转录之前使用扩增级的DNaseⅠ对RNA进行处理以除去沾染的DNA。将样品在2.0mM EDTA中65℃保温10分钟以终止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖于镁离子的RNA水解。

 

通常我们通过设计不同的外显子退火引物来将合成的cDNA与合成的沾染的基因组DNA分开。因为来自cDNA的PCR合成物短于沾染的基因组DNA的合成物，通常实验人员会针对于单个的RNA模板做一个没有逆转录的参照实验，目的在于鉴定这一个给定的片段产生于基因组DNA还是cDNA。实验结果应该是在没有逆转录发生的这一组实验中所得到的基因产物应该来自基因组。