Rt-pcr怎么样提高cDNA 的合成产量？

1.PCR反应体系的组成，如酶离子的浓度等也会显著影响 ；

2.PCR条件，如引物的退火温度选择对提高PCR试验的灵敏度和产量也非常关键；

3.如果PCR产量较低的话，你也可以通过二次PCR来提高产量，即把第一次的PCR产物适当稀释，再以它作为模班进行PCR，同时你也可以通过TOUCH-DOWN PCR来提高PCR的特异性和产量。

1）PCR的体系组成的合理，尤其是适宜的引物和模板的浓度，如果某种成分的量加大或减少都会显著的影响PCR的产量和特异性；

2）合适的模板浓度：起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数扩增满意，104到106个起始目的分子就足以在溴化乙锭染色胶上观察到，所需的最佳模板量取决于基因组的大小；

3）酶的选择：除了使用高质量模板DNA，聚合酶的选择也会影响产量；

随机引物虽能确保长基因的 5’末端的转录，但并不能获得 整个基因全长的 cDNAs，且对 RNA 样品质量要求比较高，此时可用 6-8 个核酸聚合体来提 高 cDNAs 的合成量

首先要提高mRNA的质量，260/280，260/230，都要在1.8-2之间，然后将mRNA稀释到100ng/ul左右进行反转，使用带gemonic dna Romover的rt kit，一般得到的cdna是可以的

使用进口的逆转录试剂盒，加大RNA模板浓度

提高逆转录的效率和灵敏度：

1）选择合适的逆转录引物

逆转录引物选择指南 特征优点缺点结合方式Oligo (dT)1）12-20个T；2）与真核生物mRNA的3’ Poly A尾配对。可合成全长cDNA。

1）仅扩增有polyA尾的mRNA；2）对模板质量要求高。 Random Primers1）6-9个碱基；

2）可随机识别模板并结合。适合复杂结构和微量模板。特异性低，小片段多。 基因特异性引物（GSP）识别特定模板序列。特异性强，灵敏度高。仅合成特定的序列，不适合研究同一个样本中多个基因。 2）选择合适的逆转录酶

对于逆转录酶的选择，目前科研领域常用的逆转录酶主要有AMV， MMLV，以及基于这两种酶改造的其他逆转录酶。Yeasen Hifair酶经过分子改造后，删除了MMLV原有的RNase H活性，避免了模板RNA的降解；同时具有更高的反应温度，针对一些高GC含量，以及富含复杂二级结构的RNA模板具有更强的逆转录效率

成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍/酸性酚的一步法。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品(如胰脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离心5分钟。