cDNA第一链的合成

通过体外无细胞系统翻译找出目的基因mRNA以后，变可进行cDNA第一链的合成，其步骤包括：

1）在Ependorf管中加50pmol/L的一种α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl（10μg），100m mol/L甲基氢氧化汞1μl，室温反应l0分钟，使RNA变性。
2)加100m mol/L的β-巯基乙醇2μl和10m mol/L RNA酶抑制剂2μl，室温放置5分钟。β-巯基乙醇有稳定逆转录酶活性的作用。
3)向上述反应混合物加lmg／ml的引物01igo dT(12～18聚体)10μl，1mol／L Tris.HCl(pH8.3)5μl，11mol／L KCl7μl，250m mol／L MgCl22μl，再加20 m mol／L的4种dNTP各2.5μl，逆转录酶2μl（40单位），用水补充到50μl，充分混匀，42℃反应1～3小时。
4)加0.5 EDTA(pH8.0)2μl终止反应，然后加150m mol／L NaOH 25μl，65℃反应1小时，或37℃8小时，水解mRNA模板，得到cDNA第一链，再加pH8.0，1m mol／L Tris.HCl，各25μl中和其pH。
5)测定放射活性，计算合成的DNA量。实际上，cDNA第一链的产量往往不会超过poltAmRNA用量的10%～30%。
6)用等体积的酚-氯仿抽提—次，取水相并用SephadexG-100离心柱层析(参看第6章)将cDNA同剩余的dNTP分开，以2.5倍体积的95％冷乙醇沉淀。
7)合成的cDNA第—链在1.4％的碱性琼脂糖凝胶上电泳，用末端标记的pBR322限制性片段为分子量标准，电泳后，铺X-光片，进行放射自显影，确定cDNA第一链的大小。